RNA干扰下调CDK9表达对人外周血T淋巴细胞增殖作用的研究

摘要

【目的】 CDK9(Cyclin-Dependent Kinase9，细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶9)是正性转录延长因子b(Positive Transcription Elongation Factor b，P-TEFb)的催化亚基，通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)和一些负性转录延长因子(Negative Elongation Factor)从而使转录从起始部位得以延伸。CDK9被认为无论在生理情况下还是在疾病发生中，从肿瘤的形成到HIV-1编码的Tat蛋白反转录激活中均具有重要作用。本研究通过靶向性小干扰RNA(siRNA)，特异性沉默CDK9基因的表达，研究其对人外周血T淋巴细胞增殖的作用，从而进一步为艾滋病和肿瘤的发病机制和治疗提供基础研究。 【方法】 利用体外转录合成的方法合成针对CDK9分子的小干扰RNA，脂质体法将不同浓度梯度siRNA转染人外周血T淋巴细胞，并在转染后不同时间点收取细胞分别采取RT-PCR和Western Blot观察干扰后CDK9的mRNA和蛋白表达水平；流式细胞仪检测干扰后T细胞凋亡率变化和细胞周期变化，从而探讨CDK9分子在人外周血T淋巴细胞增殖中的作用。 【结果】 (1)靶向CDK9基因的siRNA可以有效的抑制CDK9基因的表达，其中SⅠ siRNA干扰效果最强，选为最佳siRNA，RT-PCR显示mRNA表达水平相比对照组下调达90％以上；Western Blot显示两条CDK9条带：分子量分别为42kD和55kD：55kD的蛋白表达减少可达90％以上，42kD的蛋白表达减少50％； (2)流式细胞术检测T淋巴细胞凋亡率转染组为23.98％±0.030％，与阴性对照组14.76％±0.067％和空白对照组16.72％±0.043％比较有显著提高，具有显著统计学差异(P<0.01)；而阴性和空白对照组相比无明显统计学差异。(3)流式细胞术检测干扰CDK9表达后细胞周期相比阴性对照组和空白对照组无明显变化。 【结论】 靶向CDK9基因的siRNA可以有效的抑制CDK9分子的表达，对55kD的CDK9分子的抑制更显著。CDK9 下调后T细胞凋亡率显著增加，表明CDK9对外周血T细胞的存活增殖具重要作用，CDK9下调后细胞周期无明显变化，表明CDK9对细胞周期无明显调节作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第一章引言

第二章实验部分

第一节实验材料和仪器

第二节实验方法

第三节实验结果

第三章讨论

第四章结论

参考文献

附录

个人简历

致谢

论文综述：CDK9/Cyclin T(P-TEFb)及其生物学功能