丹参多糖和丹参素钠促进人外周血T淋巴细胞增殖药理作用及机制研究

摘要

目的：研究丹参多糖(Salvia miltiorrhiza polysaccharide,SMP)和丹参素钠(sodium Danshensu,SDSS)对人外周血T淋巴细胞增殖和杀伤活性的影响及其作用机制。
　　方法：采用水提醇沉法提取SMP并纯度鉴定；Ficoll密度梯度离心法分离人外周血淋巴细胞，细胞分为两部分，一部分淋巴细胞加药处理，流式细胞仪检测不同浓度SMP和SDSS对淋巴细胞表型(CD3+、CD14+、CD19+、CD56+)的影响；倒置荧光显微镜、细胞计数仪和CFSE染色考察不同浓度SMP和SDSS对淋巴细胞增殖的影响；钙黄绿素法检测其对淋巴细胞杀伤能力的影响；一部分细胞按照CIK培养，加入细胞因子刺激活化，按照上述步骤检测两种药物对CIK细胞增殖的影响。
　　提取细胞样品总RNA和蛋白，用RT-PCR检测细胞增殖相关基因IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TLR家族mRNA基因表达变化。用Western Blotting检测MAPK信号通路和NF-κB信号通路相关蛋白ERK、JNK、IκBα、p-p65等蛋白的变化。为验证SMP和SDSS刺激T淋巴细胞增殖活化是否是通过MAPK信号通路和NF-κB信号通路发挥作用，分别用ERK抑制剂(U0126)、JNK抑制剂(SP600125)和IκBα抑制剂(BAY11-7082)和药物处理细胞，Western Blotting检测p-JNK，p-ERK，p-p65，IκBα，IKKα和IKKβ蛋白表达变化，用细胞计数仪检测加入抑制剂后T淋巴细胞的数目变化。
　　结果：SMP(25、50、100μg/mL)和SDSS(6.25、12.5、25μM)可剂量依赖性的促进PBMC和CIK细胞增殖，显著提高T淋巴细胞的杀伤能力；不同程度增强IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γmRNA和TLR1、TLR2、TLR4 mRNA基因表达；Western blotting结果证实SMP(25、50、100μg/mL)和SDSS(6.25、12.5、25μM)处理外周血淋巴细胞24h后，使p-ERK、p-JNK、IKKα、IKKβ表达上调，且p-ERK、p-JNK和IKKβ蛋白表达呈剂量依赖性，IκBα蛋白表达下调，细胞质内p-p65蛋白表达呈剂量依赖性下调，细胞核内p-p65蛋白表达呈剂量依赖性上调。U0126、SP600125和BAY11-7082抑制剂阻断信号通路后，SMP和SDSS药物处理组MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达量显著降低，淋巴细胞数目减少。
　　结论：SMP和SDSS能通过Toll样受体激活MAPK和NF-κB信号通路促进T淋巴细胞增殖，增强T淋巴细胞的杀伤作用，提高机体免疫力。

目录

声明

第一章 序言

1.1研究背景

1.2研究目的、意义

1.3研究内容

1.4研究路线

第二章 SMP和SDSS促进人外周血淋巴细胞增殖药效学研究

2.1前言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4结果

2.5小结

第三章 SMP和SDSS对T淋巴细胞增殖机制研究

3.1前言

3.2材料

3.3实验方法

3.4结果

3.5小结

讨论

参考文献

附录一 英文缩略词表

附录二 攻读学位期间发表的论文

致谢