位点特异性结合蛋白对DNA拓扑结构的影响

摘要

DNA是细胞内最主要的遗传物质，其三维结构对细胞内DNA复制和RNA转录等生理活动有非常大的影响。因此，研究DNA的拓扑结构形式及其包装方式具有非常重要的意义。 体外转录的研究表明：在缺少拓扑异构酶I的体外转录中，作为结合在DNA双链上的屏障，特异DNA结合蛋白可以有效的抑制DNA双链的自身旋转以阻止孪生结构域前后的正负超螺旋结构的中和，使旋转酶(Gyrase)有更多的机会将“瞬时的”正超螺旋转变为“永久的”负超螺旋，使质粒DNA的负超螺旋达到非在体内结合蛋白对质粒DNA拓扑结构的影响。 我们将表达Lac I结合蛋白的质粒与含有一个单独表达基因的质粒一起转化到不同大肠杆菌细胞中。结果表明，在大肠杆菌细胞DM800(topA<'->gyrB225)中含有tetA基因的质粒会产生高度负超螺旋结构，当细胞中含有Lac I蛋白时，Lac I蛋白的结合可以促使对数期质粒DNA．负超螺旋程度增强，当细胞培养到静止期时质粒的超螺旋水平都有很大程度的下降，同时高度负超螺旋结构消失，但当静止期细胞重悬于新鲜培养基中培养时，质粒DNA的超螺旋水平很快恢复。当静止期细胞在加入萘啶酮酸的新鲜培养基中培养时，大肠杆菌DM800细胞中只要Lac I结合在tetA基因上游其高度负超螺旋重新形成，Lac I结合在tetA基因下游则不能重新形成高度负超螺旋，说明在topA缺陷菌株中由于Lac I的结合位置的改变使得质粒DNA高度负超螺旋结构的形成对旋转酶的依赖性有所不同。 在野生型大肠杆菌细胞DM4100(topA<'+> gyr<'+>)中，在tetA基因上游结合LacI蛋白的质粒。DNA可以形成高度负超螺旋结构。经研究证实，对于这种高度负超螺旋结构的形成，Lac I蛋白的结合是起关键作用的，同时，Lac I的结合位置，tetA基因的转录，细胞生长时相以及旋转酶的作用的也是重要的影响因素。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

第一节DNA的拓扑结构和功能

第二节细胞中的DNA拓扑异构酶

1.2.1 DNA拓扑异构酶的分型

1.2.2大肠杆菌细胞中的主要拓扑异构酶

第三节质粒拓扑结构的研究方法

1.3.1嵌入试剂的插入

1.3.2琼脂糖凝胶电泳

1.3.3电子显微术

第四节质粒拓扑结构的研究现状

第五节DNA拓扑结构与基因转录的关系

第六节质粒DNA拓扑结构与位点特异性结合蛋白的关系

第七节位点特异结合蛋白对质粒拓扑结构影响的研究意义

第二章材料与方法

第一节实验材料

2.1.1实验所用的菌株和质粒（见表2.1）

2.1.2试剂

2.1.3仪器及设备

第二节实验方法

2.2.1质粒的构建

2.2.2感受态细胞的制备

2.2.3质粒DNA的转化

2.2.4质粒的小量制备

2.2.5质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.6质粒DNA的氯喹-琼脂糖凝胶电泳

第三章结果与讨论

第一节质粒构建目的与转化结果

第二节Lac阻遏子的结合对大肠杆菌topA-菌株DM800中质粒负超螺旋结构的影响

3.2.1 LacⅠ结合在tetA基因上游使pJY183在DM800中负超螺旋程度增强

3.2.2 Lac Ⅰ蛋白存在情况下其他影响质粒DNA负超螺旋程度的因素

3.2.3讨论

第三节大肠杆菌野生株DM4100中Lac阻遏子的结合使质粒形成高度负超螺旋结构

3.3.1 LacⅠ结合在tetA基因上游使pJY183在野生型细胞DM4100种形成高度负超螺旋结构

3.3.2在野生型细胞DM4100中Lac Ⅰ结合位置对质粒结构的影响

3.3.3影响Lac Ⅰ结合诱导的DM4100中质粒DNA负超螺旋的其他因素

3.3.4讨论

第四章结论

参考文献

致谢

附录

个人简历