洋葱转脂蛋白的钙调素结合活性及抗真菌活性分析

摘要

钙调素 (calmodulin，CaM) 是Ca<'2+>信号转导系统中极其重要的组成部分，其功能通过与各种钙调素结合蛋白(calmodulin binding protein，CaMBP)的相互作用而实现。CaMBP-10 为本研究组近年在中国大白菜中发现并分离到的一种新的具有重要生理意义的钙调素内源结合蛋白，同时确认它是植物非特异性转脂蛋白家族(nsLTPs)中的新成员，首次将CaM和nsLXPs联系到一起。近期研究证明，除CaMBP-10外拟南芥和玉米的nsLTP均能与CaM结合。这说明nsLTP可能是一类新的CaM结合蛋白。 为了进一步了解植物非特异性转脂蛋白与钙调素的相互作用，我们构建了一系列CaMBP-10的单点及多点突变体蛋白，并对其进行了钙调素结合活性分析，结果表明CaMBP-10与钙调素的结合依赖于其C末端CaM结合结构域中的的四个碱性氨基酸。另外，我们克隆并表达了洋葱非特异性转脂蛋白 Ace-AMP1，凝胶覆盖分析表明其具有与CaMBP-10相同的CaM结合特性，进一步分析表明，Ace-AMP1 的钙调素结合结构域位于其分子中43位到62位氨基酸残基之间，并且其钙调素结合活性与该区域内的四个碱性氨基酸直接相关。此外，我们对重组Ace-AMP1进行了体外抗真菌活性分析，结果表明其对以香蕉炭疽为代表的真菌有极为明显的抑制作用，半数抑制浓度在1.5ug/ml左右。我们还构建了Ace-AMP1的一个双点突变体，而该突变体对香蕉炭疽的抑制作用明显减弱。 以上实验结果为进一步通过转基因方法在体内研究非特异性转脂蛋白的功能及其与钙调素的相互作用奠定了坚实的基础。

目录

文摘

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第一章引言

第一节Ca2+/CaM信号转导系统

第二节植物非特异性转脂蛋白

第三节钙调素结合蛋白CaMBP-10

第四节选题背景

第二章实验材料与方法

第一节实验材料与试剂

第二节实验方法

2.2.1洋葱nsLTP的克隆与表达质粒的构建

2.2.2洋葱nsLTP的表达与纯化

2.2.3洋葱nsLTP的CaM结合活性分析

2.2.4洋葱nsLTP的CaM结合结构域分析

2.2.5洋葱nsLTP的CaM的结合位点分析

2.2.6重组洋葱nsLTP及其突变体的抗真菌活性分析

2.2.7CaMBP-10的CaM的结合位点分析

第三章实验结果

第一节洋葱nsLTP的克隆与表达质粒的构建

第二节洋葱nsLTP融合蛋白的表达和纯化

第三节洋葱nsLTP的CaM结合活性分析

第四节洋葱nsLTP的CaM结合结构域的定位

第五节洋葱nsLTP的CaM结合位点分析

第六节重组洋葱nsLTP及其突变体的抗真菌活性分析

第七节洋葱nsLTP与CaMBP-10的CaM的结合位点比较

第四章讨论

第一节洋葱非特异性转脂蛋白Ace-AMP1的钙调素结合活性

第二节Ace-AMP1的钙调素结合结构域及结合位点

第三节植物nsLTP的抗真菌作用

第四节实验方法的改进

第五章结论

致谢

参考文献

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