Vav1蛋白调节Jurkat T淋巴细胞钙信号传导的研究

摘要

T淋巴细胞钙信号的活化能够调节核转录因子NFAT（nuclear factor ofactivated T cells）的活性，并导致1L-2等重要细胞因子的表达，对T淋巴细胞的发育和功能具有重要意义。T细胞受体被激活后，通过一系列的蛋白质相互作用和酶的级联反应，磷脂酶PLC-γ1被活化，产生第二信使IP3和DAG，并最终引起胞内钙离子的动员，其中包括胞内钙库钙离子的释放和随后发生的钙耗竭引起的胞外钙离子内流。IP3（inositol1，4，5-trisphosphate）的受体IP3R是控制胞内钙离子释放的主要分子，IP3R（inositol1，4，5-trisphosphate receptor）的活性受到多种方式的调节，PKC，PKA，和Fyn等蛋白激酶能够通过磷酸化IP3R影响其的活性，而钙调素蛋白Calmodulin等分子也能通过分子间的相互作用调节IP3R介导的钙离子释放。
　　 Vavl是在造血细胞中表达的鸟苷酸交换因子，能够通过多种信号传导途径控制细胞骨架重排以及T细胞的活化。研究表明，Vavl能够对T细胞受体（T cellrecepto，TCR）介导的细胞钙信号传导进行调节。在Vavl缺失的细胞中，TCR活化引起的胞内钙离子动员存在重大缺陷，目前的研究表明，Vavl可能通过两种途径影响细胞钙信号，其一是做为支架蛋白，通过分子间的作用促使PLC-γ1的定位于免疫突触附近的信号传导复合物上，其二是做为鸟苷酸交换蛋白（GEF），通过PI3k-TeC-PLC-γ1途径进行间接调节。
　　 本文利用敲除Vavl的Jurkat细胞系（J.Vavl细胞）进行研究，发现在胞内钙库钙释放和胞外钙离子内流这一双阶段的钙离子流动过程中，Vavl仅仅对细胞的钙离子释放进行调节。在PLC-γ1完全活化的情况下，TCR活化引起的J.Vavl细胞钙离子释放仍然存在缺陷，表明Vavl对于钙信号的调节存在未知机制。蛋白结合分析结果表明，Vavl能够与钙信号调节蛋白钙调素（calmodulin，CaM）以钙离子依赖和TCR活化非依赖的方式结合，其结合位点位于Vavl的CH（calponin homology）结构域。进一步的实验证明，如果在J.Vavl细胞中稳定表达CH结构域缺失的Vavl突变体，TCR介导的钙离子动员以及NFAT活性的缺陷仍然存在，并且与在J.Vavl细胞中观察到的的缺陷类似；若用钙调素抑制剂对Jurkat细胞进行处理，也能够观察类似的缺陷，以上结果表明Vavl与钙调素的相互作用能够增强细胞钙信号传导。
　　 NFAT活性受到两类钙信号的调节，即细胞钙离子浓度和胞内钙离子振荡信号。进一步的研究表明，J.Vavl细胞中发生自发钙振荡的细胞数以及钙振荡频率都明显低于Jurkat细胞，提示Vavl可能通过参与多种形式的钙离子信号传导的调节来影响T淋巴细胞的功能。
　　 T淋巴细胞钙信号传导对于免疫反应的调节具有重要意义，因此受到多种机制的精密调控。钙离子通道IP3R是细胞钙信号调节的枢纽之一，Vavl与CaM的结合，可能通过分子相互作用的方式对IP3R的活性进行调节，进而控制细胞钙信号传导。这一新的调控机制，对于理解Vavl蛋白在T细胞活化过程中所起的作用提供了新的依据。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 引言

第一节 T淋巴细胞的活化与T淋巴细胞介导的细胞免疫应答

1.1.1 T淋巴细胞活化的分子基础

1.1.2 TCR介导的信号传递过程中分子事件

第二节 VAv蛋白的结构与功能

1.2.1 VAv蛋白家族

1.2.2 VAv的蛋白结构

1.2.3 VAv的活性调控

1.2.4 VAv在TCR介导的细胞信号传导中的作用及其机制

1.2.5 VAv的生物学功能

第三节 T淋巴细胞中的钙信号传导

1.3.1 T淋巴细胞钙信号传导的分子机制

1.3.2 钙信号的编码在T淋巴细胞中的功能

1.3.3 细胞钙振荡

第二章 VAV1调节JURKAT T细胞胞内钙离子释放

第一节 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验原理及方法

第二节 实验结果

2.2.1 Vau1对于TCR介导的钙释放和钙流入的影响

2.2.2 过矾酸钠刺激下细胞钙离子的释放

第三章 VAV1与钙调素蛋白的相互作用及作用位点的分析

第一节 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

第二节 实验结果

3.2.1 Vav1与CaM的结合分析

3.2.2 Vav1与CaM结合位点的定位

第四章 VAV1与CAM结合调节JURKAT T细胞钙信号传导

第一节 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验原理及方法

第二节 实验结果

4.2.1 pHIV-Vav1和pHIV-Vav1△CH质粒的构建

4.2.2 慢病毒介导的Vav1的重组的鉴定

4.2.3 CaM抑制剂W-7对于细胞钙释放的影响

4.2.4 Vav1的CH结构域对于PLC-γ1磷酸化以及钙释放的影响

4.2.5 CH结构域对NFAT活性的影响

4.2.6 Vav1对细胞钙振荡的影响

第五章 结语

参考文献

致谢

附录

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果