肺癌细胞系NCI-H460中癌干样细胞的分离与鉴定

摘要

背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，病死率高。虽然一些新的化疗药物和放疗技术能够在一定程度上改善肺癌患者的生存质量，但并没有从根本上降低肺癌的死亡率，其五年生存率仍相当低，约为15％，多死于肿瘤的复发和/或转移。引起肿瘤复发的原因可能与肺癌细胞对化疗的耐药性和对放疗的抗性有关。近几年来，随着干细胞与人类基因研究的深入，在一些肿瘤细胞系和实体瘤中证实存在极少量的干细胞样癌细胞，称之为癌干细胞(cance.ste.cell/cance.stem-likecell，CSC)，可能是肿瘤发生、进展、转移和复发的启动细胞。肺癌组织中也可能存在一小群这样的细胞。关于肺癌CSC，最近才有很少的文献报道，专题研究人肺大细胞癌中的CSC未见文献报道。研究肺癌CSC，检测其干细胞样标志物，将为进一步揭示肺癌的发生和进展的机制提供线索，也将为针对CSC的药物或基因靶向治疗肺癌提供实验资料。
　　 目的：分离肺癌细胞系NCI-H460中的侧群(sid.population，SP)细胞，检测其干细胞样标志物；鉴定其SP细胞中可能富含CSC的特性。
　　 方法：研究对象为人肺大细胞癌细胞系NCI-H460细胞。
　　 (一)NCI-H460细胞系SP细胞及其干细胞样标志物的检测
　　 (1.RPMI.1640培养基用作细胞培养并用CCK-8法绘制细胞生长曲线；
　　 (2)无血清培养法观察NCI-H460细胞系肿瘤球形成情况；
　　 (3.Hoechst33342荧光染色流式细胞分选技术对肺癌细胞系NCI-H460中SP进行检测及分选；
　　 (4)RT-PCR法检测NCI-H460细胞、无血清培养肿瘤球、SP细胞和non-SP细胞中干细胞样标志物ABCG2和SMOmRNA的表达。
　　 (二)NCI-H460中SP细胞的体外培养和NOD/SCID小鼠体内成瘤实验
　　 (1)用无血清培养方法及CCK-8细胞增殖实验分析分选出的SP细胞和non-SP细胞体外增殖和分化的能力；
　　 (2)将SP细胞和non-SP细胞分别接种到NOD/SCID鼠皮下，观察其体内成瘤情况；
　　 (3.RT-PCR法检测SP组和non-SP组移植瘤中干细胞样标志物ABCG2和SMOmRNA的表达。
　　 (三)Cyclopamine靶向SMO对体外培养NCI-H460细胞的抑制作用
　　 (1)CCK-8细胞增殖实验，检测Cyclopamine对肺癌细胞系NCI-H460生长和增殖的影响；
　　 (2)流式细胞技术分析Cyclopamine对NCI-H460细胞周期的影响；
　　 (3)PT-PCR法检测空白对照组、Tomatidine对照组和Cyclpamine处理组中SMOmRNA的表达情况。
　　 (四)统计学方法实验结果以均数±标准差(χ±s)表示，运用SPSS11.5统计软件进行统计分析；计量资料采用独立样本t检验、单因素方差分析和直线回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 (一)NCI-H460细胞系SP细胞含量及其干细胞样标志物的表达
　　 (1)在无血清培养条件下，NCI-H460细胞形成悬浮生长的肿瘤球；
　　 (2)NCI-H460中SP细胞含量为(6.23±0.78)％；
　　 (3)ABCG2和SMOmRNA在NCI-H460细胞、肿瘤球以及分选的SP细胞中均有表达，其表达水平依次增高。在non-SP细胞中不表达。
　　 (二)NCI-H460中SP细胞的体外培养和NOD/SCID小鼠体内成瘤
　　 (1)在无血清培养条件下，SP细胞的肿瘤球形成率为(4.82-0.07)％，其肿瘤球传代可形成子代肿瘤球，而non-SP细胞在观察期限内极少见肿瘤球形成(0.82±0.27)％(P<0.001)；
　　 (2)CCK-8增殖实验显示，SP细胞比non-SP细胞具有更强的体外增殖能力(P<0.01)：
　　 (3)SP细胞形成的肿瘤球重新用有血清的常规培养液培养后，再次进行SP细胞含量检测，含量为(3.80±0.59)％，而non-SP组则未能检测出SP：
　　 (4)在一定细胞浓度条件下，SP组NOD/SCID鼠最早成瘤时间为第6天，最终成瘤率为100％(7/7)；non-SP组最早成瘤时间为第11天，最终成瘤率为67％(4/6)。SP组移植瘤的生长速度明显快于non-SP组，各个时间点瘤体积的差异均有统计学意义(P<0.01)；
　　 (5)SP组在接种浓度为5×103个/只时即可成瘤，而non-SP组在接种浓度为5×104个/只时才形成肿块，且各接种浓度中SP组的肿块体积均明显大于non-SP组(P<0.001)；
　　 (6)SP组移植瘤中再检测SP的含量为(8.37±0.61)％，而non-SP组移植瘤中SP的含量则为(1.43±0.21)％(P<0.001)：
　　 (7)SP组移植瘤组织表达ABCG2和SMOmRNA的水平明显高于non-SP组的表达水平。
　　 (三)Cyclopamine靶向SMO对体外培养NCI-H460细胞的抑制
　　 (1)与空白对照组和Tomatidine对照组相比，2μmol/L～40μmol/L的Cyclopamine对NCI-H460细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，20μmol/LCyclopamine使NCI-H460细胞生长曲线下移，并可将NCI-H460细胞阻滞在G1期，明显减少其S期细胞数量，作用96h时可引起细胞凋亡。
　　 (2)与空白对照组和Tomatidine对照组相比，Cyclopamine处理组SMOmRNA的表达受到明显抑制(P<0.001)。
　　 结论：
　　 (1)人肺大细胞癌细胞系NCI-H460的SP细胞中可能富含假设的CSC，并发现non-SP中也可能含有显著低微量的CSC；
　　 (2)NCI-H460的SP细胞在体内外均具有较强的自我更新和增殖能力，并具有一定的分化潜能，可分化成SP细胞和non-SP细胞；non-SP也可能有极少数细胞具有向SP细胞转化的潜能；
　　 (3)NCI-H460的SP高表达干细胞样标志物ABCG2和SMO。Cyclopamine靶向Sonic Hedgehog(Shh)通路中的SMO分子可在体外抑制NCI-H460细胞，提示SMO可能成为肺大细胞癌CSC靶向治疗的靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

第1章 前言

第2章 NCI-H460细胞系SP细胞及其干细胞样标志物检测

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 NCI-H460中SP细胞的体外培养和NOD/SCID小鼠体内成瘤实验

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 Cyclopamine靶向SMO对体外培养NCI-H460细胞的抑制作用

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 结论与展望

5.1 小结

5.2 进一步工作的方向

参考文献

致谢

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果

发表论文一

发表论文二