大肠杆菌和志贺氏菌O抗原合成基因簇的鉴定及病原菌诊断用基因芯片的研制

摘要

本文对某些重要大肠杆菌和志贺氏菌O抗原基因簇进行测序和分析，从基因簇中筛选出针对每一种血清型的特异基因，为O抗原基因分型方法的建立奠定了基础。本文还研制了两张病原菌诊断用基因芯片，其中猪断奶期腹泻（post-weaning diarrhea，PWD）和水肿病（edema disease，ED）相关大肠杆菌血清型和毒力基因检测芯片正是利用O抗原基因簇中的特异基因设计和筛选探针，是O抗原测序和分析工作的延伸。
　　 Ⅰ
　　 致病性大肠杆菌和志贺氏菌是人类和许多动物的肠道致病菌，前者亦可导致肠道外感染。志贺氏菌与大肠杆菌的进化地位十分接近，有许多共同的生化和分子遗传学特征。O抗原是革兰氏阴性细菌表面的主要抗原，是由重复寡糖单位组成的多聚糖，由于长期受到宿主的选择压力而具有高度的多样性。大肠杆菌目前有超过180种O抗原，志贺氏菌有33种O抗原。编码合成O抗原的基因簇是在DNA水平上研究分子进化的最好材料，同时从O抗原基因簇中筛选的特异基因是建立O抗原分子分型方法的最好的靶分子。本文利用鸟枪法完成了15株大肠杆菌和5株志贺氏菌O抗原合成基因簇的测序，这些基因簇均具有大肠杆菌和志贺氏菌O抗原基因簇的一般特征，位于持家基因galF和gnd之间，转录方向均为从galF到gnd，平均G+C含量均低于40％，显著低于大肠杆菌基因组平均G+C含量（50％）。
　　 文献报道大肠杆菌O86具有强烈的人类B血型抗原活性，这是由于O86的O抗原和人类B血型抗原具有相同的末端三糖结构。O86抗原基因簇的分析表明其中的orf9编码的蛋白与形成人类B血型抗原的半乳糖转移酶同属于糖基转移酶家族6，氨基酸序列的一致性为26％，推测orf9是负责半乳糖转移的基因，形成了具有B血型活性的三糖结构，这阐明了O86具有人类B血型抗原活性的遗传基础。
　　 大肠杆菌O119的抗原中存在一个稀有单糖（2-乙酰基-2，3-双脱氧-3-甲酰基-L-鼠李糖），O119的抗原基因簇分析表明其中的orf4、orf5、orf6和orf7编码的蛋白可能参与了该单糖的合成，并对该单糖的合成路径进行了预测。
　　 大肠杆菌O135和福氏志贺氏菌1-5型具有几乎完全一致的O合成抗原基因簇，这与O13、O129与福氏志贺氏菌1-5型的关系类似，推测O13、O129和O135以及福氏志贺氏菌1-5型具有相同的O抗原主链骨架，不同血清型是由葡萄糖或者O乙酰基的侧链修饰造成的，编码侧链修饰的基因定位于O抗原基因簇之外的溶源性噬菌体基因组上。
　　 根据文献，鲍氏志贺氏菌3型、14型和痢疾志贺氏菌6型、11型、13型分别与大肠杆菌O167、O32、O130、O29和O150具有紧密相关的血清学交叉反应，本文完成了这几株志贺氏菌O抗原基因簇的测序，通过和相关大肠杆菌抗原基因簇的比较，阐明了它们O抗原紧密相关的遗传基础。
　　 本文还利用所有大肠杆菌和志贺氏菌O标准菌株的基因组进行扩增的方法鉴定了本文所涉及的部分血清型的的特异基因，为建立大肠杆菌和志贺氏菌O抗原基因分型方法奠定了基础。
　　 Ⅱ
　　 基因芯片是一种可以对核酸分子进行平行和高通量检测的技术，本文研制了两张病原菌诊断用基因芯片。PWD和ED是两种最重要的引起猪发病和死亡的疾病，通常出现在断奶后14天的幼猪中，给养殖业造成巨大的经济损失。大肠杆菌是引起这两种疾病的最重要的病原菌。全球范围内最常报道的与这两类疾病相关的大肠杆菌血清型包括O8、O45、O138、O139、O141、O147、O149和O157，相关的毒力因子包括黏附因子（F4、F18、F5、F6、F41和intimin）和外毒素（STa、STb、LT、Stx2e和EAST1）。本实验室的前期研究已经对其中3种抗原合成基因簇进行了测序，另外5种的序列已经公布。本文利用抗原基因簇中的特异基因以及毒力基因设计引物和探针。对于具有相同O抗原合成基因簇的O149和鲍氏志贺氏菌1型以及O147和福氏志贺氏菌6型，利用ipaH基因（特异于志贺氏菌和肠侵袭型大肠杆菌）设计引物和探针进行区分。所有引物分为两组分别首先进行多重PCR，一组用于检测血清型，另一组用于检测毒力基因。然后多重PCR的产物用作模板，只加入下游引物进行扩增和标记，标记产物与芯片杂交。每一组中还含有一对基于16S rRNA基因保守区设计的引物，其扩增标记产物可与基于16S rRNA基因保守区的正对照探针杂交，起到对芯片的检测过程正向控制的作用。芯片共含有55条探针，包括检测探针、正负对照探针和荧光探针。完成了芯片的特异性、灵敏度和双盲实验，并完成了17例猪粪便样品的应用性实验，结果显示该芯片具有良好的特异性、灵敏度和实用性。
　　 正常情况下血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症和败血症等，及时准确地进行病原学诊断极为重要。本文首先对血液感染病原菌的种类进行了统计，确定了该芯片的检测范围。利用16S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因设计了引物和探针，并利用公共数据库中的序列资源对基于16S rRNA基因的探针进行了特异性和敏感性分析。对血液培养物DNA提取方法（碱洗/热裂解法）进行了优化，优化的条件包括碱溶液的浓度和作用时间以及煮沸的时间。建立了利用DNaseⅠ消除商品化Taq DNA聚合酶中内源性DNA污染的方法。开发了针对该检测芯片的判读软件。初步进行了血液感染常见病原菌检测用基因芯片方法的建立，克服了传统检测方法中的某些不足，具有良好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

第一部分（Ⅰ）大肠杆菌和志贺氏菌O抗原合成基因簇的鉴定

第一章 前言

第一节 研究背景简介

第二节 本工作的研究目标、内容和创新性

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 结果与分析

第一节 15株大肠杆菌O抗原合成基因簇的分子鉴定

第二节 5株志贺氏菌O抗原合成基因簇的分子鉴定

第三节 特异基因的鉴定

第四章 讨论

第一节 大肠杆菌O86具有人类B血型活性的遗传学基础

第二节 具有相同O抗原主链骨架的O抗原组群

第三节 稀有单糖合成路径的预测

第四节 研究O抗原结构及其遗传的意义

第五章 结论

第二部分（Ⅱ）病原菌诊断用基因芯片的研制

第一章 前言

第一节 研究背景介绍

第二节 本工作的研究目标、内容和创新性

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 结果与分析

（Ⅰ）猪断奶期腹泻和水肿病相关大肠杆菌血清型和毒力基因检测芯片

（Ⅱ）引起血液感染的重要致病菌检测基因芯片

第四章 讨论

第一节 微生物检测技术的重要性和应用

第二节 用于猪PWD和ED相关大肠杆菌血清型和毒力基因检测芯片

第三节 用于血液感染重要病菌检测的芯片

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简介及科研成果