高效启动子的克隆及其在黄瓜和烟草组织中的活性分析

摘要

基因表达的最终产物是RNA和蛋白质，这两大类物质及其次级产物维持着整个生命的有序活动。任何基因表达调控程序上的缺陷，均会对生物体造成严重后果。因此，基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。蛋白质编码基因的表达需要转录和翻译两大环节，每个环节都存在着不同的基因表达调控位点。转录环节是最主要的调控位点，而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位。因此，克隆及研究启动子的功能对于基因表达调控机制及表达外源蛋白的研究具有十分重要的意义。
　　 本研究使用PCR方法从甜瓜基因组中克隆了一个双向启动子DP。通过软件分析该启动子在两个方向上的顺式作用元件后，发现一系列的诱导调控元件，如DOF-box，E-box，DPBF-core，GT1-core，MYC-core和W-box；还发现一系列预期能够启动下游基因高效转录的增强子元件，如CPB-binding motif，EEC-motif，GATA-box。
　　 用DP启动子在两个方向上取代载体pBI121上的CaMV 35S启动子，检测了该启动子在两个方向上启动gus报告基因的活性，并将DP插入到CaMV 35S启动子的下游构成双启动子，检测了其双启动子启动gus报告基因活性。结果表明，DP启动子可驱动gus基因在黄瓜的叶、茎、果实和烟草的叶、茎中表达；在上述五种组织中，DP启动子在两个方向上的活性显著高于CaMV 35S启动子；由DP和CaMV 35S构成的双启动子活性反而低于单个DP启动子在相应组织中的启动子活性。
　　 上述结果证明，甜瓜的DP是一个天然的双向启动子，且其在不同组织中启动子活性显著高于CaMV 35S启动子，但不适于将DP插入到CaMV 35S启动子下游组成双启动子在黄瓜和烟草中驱动下游基因的表达。
　　 本研究首次从甜瓜基因组中克隆了一个天然的双向启动子，为进一步了解植物的生长发育过程、探讨植物对其生长环境的适应机制以及更好地控制外源基因在转基因植物中的表达等奠定了一定基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 研究的目的和意义

第二节 植物启动子的结构和功能

1.2.1 转录起始位点

1.2.2 启动子的组成

第三节 植物启动子的分类

1.3.1 组成型启动子

1.3.2 组织特异性启动子

1.3.3 诱导型启动子

1.3.4 双向启动子

1.3.5 可变启动子

第四节 植物启动子的克隆及分析方法

1.4.1 克隆方法

1.4.2 植物启动子的分析方法

1.4.3 植物启动子的计算机识别方法

1.4.4 真核生物启动子预测相关数据库资源

第二章 实验材料和方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 质粒和植物材料

2.1.3 试剂来源

2.1.4 主要仪器

第二节 主要试剂及培养基配制

2.2.1 培养基

2.2.2 主要化学试剂及缓冲液配制

第三节 实验方法

2.3.1 启动子DP的克隆

2.3.2 植物表达载体的构建

2.3.3 农杆菌工程菌株的筛选

2.3.4 外植体的准备和基因转化

2.3.5 GUS组织化学染色

2.3.6 GUS活性的定量分析

2.3.7 数据分析

第三章 结果与分析

第一节 植物启动子DP的克隆及分析

3.1.1 启动子DP的克隆

3.1.2 pMD-DP克隆载体的构建

3.1.3 DP序列分析

第二节 植物表达载体的构建

3.2.1 植物表达载体的构建过程

3.2.2 植物表达载体的鉴定

第三节 工程农杆菌菌株的筛选

3.3.1 根癌农杆菌的转化

3.3.2 农杆菌重组子的鉴定

第四节 启动子功能分析

3.4.1 DP在正反两个方向上启动子功能的定性分析

3.4.2 DP启动子在黄瓜和烟草不同组织中活性的定量分析

第四章 讨论

第五章 结论

致谢

参考文献

个人简历