以硅胶为载体的蛋白质分子印迹的研究

摘要

蛋白质印迹是制备对模板蛋白具有特异选择性功能的分子印迹技术。因其本身性能的限制，进展相对缓慢，技术尚不成熟，仍需要改进常规的制备和分析方法来适应生物模板的物理性质(模板蛋白大小，相容性、构象灵活性、水溶性)，以及其稳定性，选择性，位点可接近性，和成本效率等方面的缺点。
　　 本论文主要对硅胶表面蛋白质分子印迹的制备及识别性能进行了深入的研究，考察了聚合物的吸附性质与识别选择性，并对分子印迹技术在蛋白质分离和富集领域的应用作了初步探讨。本论文共六个章节，工作可归纳为以下四个主要部分：
　　 一、综述了蛋白质分子印迹的研究现状及发展前景，以及本论文工作的意义。
　　 二、在第二、三章中，采用紫外光谱法从分子水平考察了摩尔比、溶液pH值、离子强度对功能单体与模板蛋白之间相互作用的影响。并在最佳条件下，选择硅胶作为固体致孔剂，采用本体聚合法制备了以溶菌酶、牛血红蛋白为模板蛋白的聚丙烯酰胺印迹凝胶聚合物。竞争性吸附实验表明，硅胶作为致孔剂提高了分子印迹聚合物对模板蛋白的识别特异性；同时也显著地增加了分子印迹聚合物对模板蛋白的吸附容量。说明加入具有大孔和较大比表面积的致孔剂作为牺牲载体是提高凝胶聚合物的吸附容量和吸附选择性的有效途径。
　　 三、在第四章中，采用水解缩聚法，制备了一种新型的无机.有机杂化分子印迹聚合物；这种方法兼具硅烷试剂的水解缩聚的简便，和壳聚糖作为有机体生物兼容性良好的优点；即具有易制备，亲和性能高和低溶胀性等特点。吸附实验表明，杂化印迹聚合物对牛血红蛋白有良好的吸附容量和特异性。即使在蛋白质的混合溶液中，具有特异性吸附的分子印迹作用始终对模板蛋白起着重要作用。
　　 四、在第五、六章中，采用不同的方法对硅胶表面进行修饰，使硅胶具有良好的生物兼容性，并能有效的固定化模板蛋白；然后在其表面形成具有识别蛋白质功能的聚合物薄膜。第五章的修饰过程为选用γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷试剂对其表面进行修饰，环氧基团开环后再结合能固定化蛋白质马来酸酐分子。因其又带有乙烯基，可与功能单体.丙烯酰胺共聚，使分子印迹聚合物薄层与载体之间结合牢固。在第六章中同样用环氧基团修饰硅胶表面，环氧开环后与壳聚糖反应，在硅胶表面引入生物兼容性良好的壳聚糖，并用双官能团试剂-戊二醛将模板蛋白与壳聚糖偶联，共价固定模板蛋白。硅胶表面修饰法避免了研磨筛分等繁琐的程序，又能根据需要选择合适的尺寸，适合作为色谱固定相。同时，考察了蛋白质印迹聚合物对模板蛋白以及其非模板蛋白的吸附选择性，探讨了分子印迹聚合物对模板蛋白的识别机理；用其分离蛋白质混合溶液中的模板蛋白，得到了较为理想的结果，说明制备的蛋白质印迹聚合物能应用于蛋白质溶液的分离纯化。
　　 基于上述，本论文的工作为分子印迹在蛋白质样品的分离提供了理论依据，并实现了简单样品的分离和纯化。随其发展，有望实现模板蛋白的富集作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 自然界的识别系统

1.2.1 蛋白质识别

1.2.2 免疫系统中的分子识别

1.2.3 细胞的分子识别

1.3 设计合成具有分子识别性能的生物材料

1.3.1 早期生物材料尝试

1.3.2 生物分子识别的策略

1.4 合成聚合物的分子识别

1.4.1 分子印迹

1.4.2 大分子量模板印迹的困难

1.5 蛋白质印迹

1.5.1 本体印迹

1.5.2 表面印迹

1.5.3 抗原决定基印迹

1.5.4 其他生物分子印迹

1.5.5 合成大分子印迹

1.6 影响蛋白质印迹聚合物选择性吸附的因素

1.6.1 pH影响

1.6.2 单体类型的影响

1.6.3 交联度的影响

1.6.4 单体与模板比率的影响

1.6.5 洗脱条件的影响

1.6.6 蛋白质不同的制备方法的影响

1.6.7 聚合溶液的影响

1.7 蛋白质印迹的存在的问题

1.7.1 水相中印迹蛋白

1.7.2 交联度的影响

1.7.3 蛋白质的洗脱

1.8 蛋白质印迹的发展方向

1.8.1 保持蛋白质活性，完善蛋白质印迹体系

1.8.2 提高蛋白质印迹聚合物的选择性

1.8.3 寻找通用的蛋白质印迹方法

1.9 结论与展望

1.10 本论文研究的内容及意义

参考文献

第二章 复合分子印迹聚合物体系选择性富集蛋白质样品中的溶菌酶

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂及仪器

2.2.2 功能单体与模板分子相互作用的研究

2.2.3 溶菌酶印迹聚合物的制备

2.2.4 吸附实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 功能单体与模板分子相互作用的研究

2.3.2 pH的影响

2.3.3 离子强度的影响

2.3.4 二氧化硅的作用

2.3.5 分子印迹聚合物凝胶的吸附动力学研究

2.3.6 等温吸附线

2.3.7 竞争性吸附实验

2.4 结论

参考文献

第三章 以致孔剂改进水凝胶法分子印迹牛血红蛋白

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器与试剂

3.2.2 功能单体与模板蛋白相互作用的研究

3.2.3 牛血红蛋白印迹聚合物的制备

3.2.4 凝胶聚合物的吸附实验

3.3 结果与讨论

3.3.1 功能单体与模板蛋白相互作用的研究

3.3.2 识别选择性

3.4 结论

参考文献

第四章 无机-有机杂化分子印迹聚合物的制备及其对牛血红蛋白的识别研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 仪器与试剂

4.2.2 分子印迹聚合物的制备

4.2.3 分子印迹聚合物的表征

4.2.4 吸附性能的检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 杂化印迹聚合物的分子识别机理

4.3.2 元素分析

4.3.3 红外光谱

4.3.4 吸附动力学研究

4.3.5 等温吸附线

4.3.6选择性吸附

4.3.7 竞争性吸附

4.3.8 杂化聚合物的重复利用

4.4结论

参考文献

第五章 硅胶接枝-表面分子印迹牛血红蛋白及其识别性能的研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂及仪器

5.2.2 分子印迹聚合物的制备

5.2.3 吸附性能的检测

5.3 结果与讨论

5.3.1 表面接枝修饰分子识别机理

5.3.2 扫描电镜

5.3.3 红外光谱

5.3.4 元素分析

5.3.5 吸附动力学研究

5.3.6 聚合物的再生

5.3.7 等温吸附线

5.3.8 选择性吸附

5.3.9 竞争性吸附

5.4结论

参考文献

第六章 壳聚糖包裹硅胶载体印迹牛血红蛋白的研究

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 试剂及仪器

6.2.2 分子印迹聚合物的制备

6.2.3 吸附性能的检测

6.3 结果与讨论

6.3.1 表面接枝分子印迹聚合物的制备

6.3.2 扫描电镜

6.3.2 扫描电镜

6.3.3 红外光谱

6.3.4 元素分析

6.3.5 吸附动力学研究

6.3.6 等温吸附线

6.3.7 选择性吸附

6.3.8 竞争性吸附

6.3.9 聚合物的再生

6.4 结论

参考文献

本文作者已(待)发表的论文目录

致 谢