Antimycin A诱导PC12细胞凋亡及其ROS和Ca在其凋亡中作用研究

摘要

目的：通过初步研究AMA对NGF诱导分化的PC12细胞的致凋亡作用，探讨在此过程中ROS和Ca2+的角色，从而为建立神经系统缺氧细胞模型提供实验基础。
　　 方法：Hoechst33342标记后，扫描共聚焦显微镜观测细胞形状和核形态。用MTT检测AMA对细胞活性的影响，Annexin V-FITC-PI荧光标记细胞，于流式细胞仪检测细胞凋亡，Fluo-3-AM标记细胞，并用激光共聚焦显微镜检测细胞内荧光强度变化来反映游离Ca2+浓度变化。用氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM—H2DCFDA)标记细胞，于流式细胞仪分析细胞内荧光强度变化来检侧细胞内ROS的变化。
　　 结果：①AMA能够通过诱导细胞凋亡降低细胞活性，并且AMA的这种作用具有时间依赖性和浓度依赖性。②AMA能够诱导细胞能产生ROS和导致胞质内游离Ca2+升高并且这种作用和AMA诱导的细胞凋亡相关。③细胞内游离Ca2+升高出现在ROS升高之后。
　　 结论：AMA通过诱导细胞凋亡降低PC12细胞活性，并且具有时间依赖性和浓度依赖性。细胞内ROS的增多和游离Ca2+的升高参与了AMA诱导的PC12细胞凋亡作用，并且ROS的增多可能是细胞内游离Ca2+的升高的原因。细胞外钙库的内流和内质网钙库的外流参与了AMA诱导的PC12凋亡。

目录

文摘

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论文说明：本文主要缩略语表

声明

第一章 前言

第一节 Antimycin A(AMA)概述

第二节 PC12细胞简介

第三节 细胞凋亡

1.3.1 细胞凋亡概述

1.3.2 细胞凋亡形态学特征

1.3.3 细胞凋亡生化特征

第四节 细胞凋亡检测

1.4.1 细胞凋亡形态学观察

1.4.2 Annexin V标记法

1.4.3 凋亡细胞的DNA片段化检测

1.4.4 线粒体膜去极化

1.4.5 caspase-3活性检测法

1.4.6 Ca2+浓度升高

1.4.7 连接介导的PCR检测(LM—PCR Ladder)

1.4.8 流式细胞术

1.4.9 TFAR19蛋白的表达和细胞定位

第五节 细胞凋亡通路

1.5.1 线粒体通路

1.5.2 死亡受体通路

1.5.3 内质网通路

第六节 Ca2+损伤神经元的主要通路

1.6.1 钙—激活钙依赖性的钾通道

1.6.2 钙激活中性蛋白酶 磷脂酶A2、DNAase等一些酶类

1.6.3 Ca2+—线粒体信号通路

1.6.4 Ca2+—内质网信号通路

1.6.5 Ca2+—NO—

第七节 Ca2+与中枢神经系统疾病

第八节 ROS与神经损伤

1.8.1 胞质内的ROS产生

1.8.2 线粒体内ROS的产生

第九节 ROS与Ca2+

第二章 实验材料与方法

第一节 细胞培养及分组

2.1.1 PC12细胞的生物学特性

2.1.2 细胞培养及处理

第二节 实验仪器与试剂

2.2.1 实验仪器

2.2.2 试剂

第三节 实验方法

2.3.1 实验分组

2.3.2 细胞活性测定

2.3.3 细胞凋亡的测定

2.3.4 细胞凋亡的形态学检测

2.3.5 细胞内游离钙离子的测定

2.3.6 细胞内ROS的测定

第四节 数据处理

第五节 实验流程

2.5.1 AMA对细胞活力的影响

2.5.2 细胞凋亡检测

2.5.3 胞内ROS与胞内游离Ca2+检测

第三章 实验结果

第一节 AMA对PC12细胞增殖的影响

第二节 AMA对细胞凋亡的影响

第三节 100μM AMA与PC12细胞作用48h时Hoechst33342荧光染色结果

第四节 AMA对细胞内ROS的影响

第五节 AMA对细胞内游离[Ca2+]动态变化的影响

第六节 ROS清除剂，膜通透性细胞内钙离子螯合剂，内质网钙外流阻断剂，L—型钙通道抑制剂对AMA诱导的细胞凋亡的保护作用

第四章 讨论

第一节 AMA对NGF诱导分化的PC12细胞活性的影响

第二节AMA诱导PC12细胞凋亡或坏死?

第三节 ROS与细胞凋亡

第四节 Ca2+与AMA诱导的PC12细胞凋亡

第五节 ROS与Ca2+

第五章 结论

参考文献

致谢

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