牛免疫缺陷病毒微管依赖性运输的研究

摘要

牛免疫缺陷病毒(BIV)属于反转录病毒科慢病毒属,与人免疫缺陷病毒(HIV)在形态学和遗传学方面具有很高的同源性。BIV是一种非致癌病毒,在感染的牛群体内,诱发中枢系统损伤和白细胞增生；在体外培养细胞中,诱导合胞体的产生。与其他慢病毒相同,BIV感染细胞后将自身RNA基因组反转录成为DNA,并以原病毒形式整合到宿主染色体。病毒是细胞的严格寄生物,必须借助宿主细胞的机制完成自身的各种生命活动。在感染早期,病毒颗粒需要从细胞边缘移动到细胞核附近进而完成复制。通过劫持马达蛋白沿着微管运动,是病毒运输的普遍机制。作为细胞的通道,微管是平行排列的αβ微管蛋白二聚体构成的管状结构,两端具有极性。在非极性细胞中,微管正极指向细胞膜,负极指向微管组织中心。病毒从细胞边缘到细胞核的运动是向微管负极的运输,称为反向运输,常需要动力蛋白(dynein)的参与；病毒从细胞核周到细胞边缘的运动是向微管正极的运输,称为正向运输,需要驱动蛋白的参与。病毒蛋白与马达蛋白亚基的相互作用被认为是病毒运输的关键。
　　 本文利用指示细胞的方法检测微管药物对BIV感染的影响,发现BIV在nocodazole处理过的细胞中的感染性显著下降,nocodazole对BIV感染的抑制作用发生在感染早期并且具有剂量依赖性。通过微管组分分离实验和对微管蛋白乙酰化的检测,发现BIV感染可以促进微管的聚合与稳定。为了进一步确定微管是否参与BIV的运输,通过免疫荧光显微镜观察了病毒颗粒在不同感染时期的亚细胞定位。感染后2小时,BIV病毒颗粒几乎都位于细胞边缘,感染8小时后移动到细胞核附近。而在nocodazole处理的细胞中,大部分病毒颗粒在感染后8小时仍定位于细胞边缘。对病毒颗粒的定量分析显示,与正常细胞相比,nocodazole使细胞核区病毒颗粒数目明显下降。此外,在免疫荧光显微镜和电镜下,我们观察到正在运输的病毒颗粒定位在微管上。这些结果证明BIV的反向运输依赖于微管。利用过表达Dynamitin使dynein功能受损的方法,检测了dynein是否参与BIV的生活周期。在Dynamitin过表达的细胞中,BIV的感染性显著下降。进一步免疫荧光实验证明了BIV感染性的下降是由于病毒颗粒反向运输受阻造成的。这些结果证明dynein是介导BIV反向运输的马达蛋白。利用酵母双杂交筛选,我们发现BIV衣壳蛋白CA与dynein轻链亚基LC8存在相互作用；通过GST-pulldown、CBP-pulldown和Co-IP实验,证明CA在体内、体外和病毒感染条件下均可以与LC8相互作用。在CA蛋白中,LC8结合区位于CA蛋白N端结构域。向细胞内转染短发夹RNA可以下调LC8的表达。BIV在LC8受损的细胞中感染性显著下降。在免疫荧光显微镜下,这些细胞中BIV的反向运输被阻断。微管组分分离实验显示,在BIV感染早期,正常细胞中CA蛋白主要存在于微管组分中,而在LC8受损细胞中CA蛋白多存在于细胞浆中。进一步的Co-IP实验证明CA可以通过LC8结合到dynein复合物上,这一结果与荧光显微镜下观察到运输中的病毒颗粒与GFP标记的dynein复合物具有共定位的现象相一致。此外,过转染CA可以有效抑制 BIV的感染,这可能是由于过剩的CA蛋白与病毒竞争性结合LC8导致的。以上结果证明LC8是BIV运输中连接病毒颗粒与微管的关键因子。本文首次描述了微管依赖性的BIV反向运输,并阐明了BIV运输的分子机制,丰富了人们对BIV生活周期的认识。通过BIV运输分子基础的揭示,对HIV乃至整个反转录病毒的相关研究具有重要的借鉴意义。所有慢病毒的研究都是以攻克艾滋病为最终目标的,我们从病毒反向运输这个角度,发现了一些在整合之前即可将病毒感染阻断的方法,为抗慢病毒药物的设计提供了新思路。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 慢病毒概况

1.1.1 慢病毒的分类学地位

1.1.2 慢病毒家族

1.1.3 慢病毒致病性

1.1.4 慢病毒分子生物学

第二节 牛免疫缺陷病毒

1.2.1 BIV简介及研究意义

1.2.2 BIV编码的蛋白及其功能

1.2.3 BIV病毒颗粒

1.2.4 BIV转录水平的调节

1.2.5 BIV转录本的生成

1.2.6 翻泽后的调节

1.2.7 BIV生活周期

第三节 微管

1.3.1 细胞骨架概述

1.3.2 微管的结构

1.3.3 微管组织中心

1.3.4 微管的极性

1.3.5 微管动力学

1.3.6 微管相关蛋白

1.3.7 微管马达蛋白

1.3.8 病毒与微管的相互作用

第四节 病毒的运输

1.4.1 病毒运输概述

1.4.2 牛痘病毒

1.4.3 腺病毒Ⅱ型

1.4.4 单纯疱疹病毒1型

1.4.5 人泡沫病毒

1.4.6 HIV-1

第五节 本研究的前期基础

第六节 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 细胞

2.1.2 菌株

2.1.3 质粒

2.1.4 主要试剂

第二节 实验方法

2.2.1 基因操作

2.2.2 蛋白的表达与纯化

2.2.3 抗体制备和效价检测

2.2.4 细胞相关试验

2.2.5 病毒相关试验

2.2.6 蛋白检测

2.2.7 蛋白相互作用检测

2.2.8 RNA干扰试验(RNAi)

2.2.9 感染细胞中微管组分的制备

2.2.10 透射电镜(TEM)

2.2.11 统计学分析

第三章 结果与分析

第一节 微管对BIV的感染具有重要作用

3.1.1 BIV指示细胞系的工作原理

3.1.2 BIV完成生活周期需要微管的参与

3.1.3 BIV感染的早期事件需要微管的参与

3.1.4 微管药物对BIV指示细胞系无影响

第二节 BIV对微管动力学的调节

3.2.1 BIV感染保护微管不被解聚

3.2.2 BIV促进微管的稳定性

第三节 BIV反向运输依赖于微管

3.3.1 BIV感染早期病毒颗粒的亚细胞定位

3.3.2 BIV的反向运输需要微管参与

3.3.3 微管是BIV反向运输的通道

第四节 BIV反向运输依赖于DYNEIN

3.4.1 BIV的感染需要dynein的功能

3.4.2 BIV的反向运输是由dynein介导的

第五节 BIV CA与DYNEIN轻链亚基LC8存在相互作用

3.5.1 筛选病毒蛋白与dynein亚基的相互作用

3.5.2 CA与LC8在体内、体外和病毒感染中都存在相且作用

3.5.3 CA蛋白中LC8结合区域的界定

第六节 LC8是介导BIV反向运输的关键

3.6.1 BIV的感染不能缺少LC8

3.6.2 BIV的反向运输需要LC8

3.6.3 LC8是连接病毒颗粒与微管和dynein的纽带

第七节 病毒早期运输受阻会推迟病毒复制

3.7.1 微管药物可以使病毒复制推迟

3.7.2 LC8基因沉默使病毒复制严重推迟

第八节 CA过剩可以抑制BIV的感染性

3.8.1 寻找抗病毒的病毒蛋白

3.8.2 CA不影响病毒的转录

3.8.3 CA对病毒的抑制可能与LC8有关

第四章 讨论

第一节 BIV感染早期事件揭秘

第二节 BIV反向运输的独特性

4.2.1 BIV感染早期对微管依赖性更强

4.2.2 BIV微管运输的效率不如HIV-1

4.2.3 BIV对微管具有独特的调节作用

4.2.4 不依赖于微管的病毒运输

第三节 病毒蛋白与马达蛋白的相互作用

4.3.1 dynein是病毒反向运输的通用马达

4.3.2 病毒货物的多样性

4.3.3 结合LC8是偶然还是必然

第四节 “以毒攻毒”的策略

第五章 结论与展望

第一节 结论

第二节 展望

参考文献

致谢

附录 A:个人履历

附录 B:在学期间完成论文

附录 C:英文缩写