环境因子对抗性基因消长动力学及耐药微生物群落结构变化的影响研究

摘要

抗生素在医药、畜牧和水产养殖业的大量使用造成环境中耐药细菌及其抗性基因在环境中的传播和扩散，因此，近年来抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物引起了研究者的广泛关注。本文采集天津海河干流的水及底泥样品，通过室内模拟泥/水复合体系，研究了不同温度、光照、有机质等环境因子以及不同抗生素初始浓度对磺胺类抗性基因(sul1，sul2)及耐药微生物群落结构的影响。模拟实验在人工气候培养箱内进行，设置2种温度条件(20℃及4℃)、2种光照条件(24小时黑暗条件及10000lux光照12/12h(开/关)条件)及2种有机质条件(高：40.94g/kg、低：28.06g/kg)。抗生素磺胺甲恶唑(SMX)浓度20℃下设置4组(未加SMX、10ug/L、80ug/L、20mg/L)、4℃下设置3组(未加SMX、10ug/L、20mg/L)，其中未加SMX为自然采集的泥水样品。利用固相萃取(SPE)、液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)及荧光定量PCR技术对模拟体系底泥中的磺胺甲恶唑(SMX)及磺胺抗性基因(sul1，sul2)进行实时定量检测。
　　 模拟体系中磺胺甲恶唑的消减动力学研究结果显示，SMX在20℃的降解速率常数k明显大于4℃(0.041 d-1 vs0.011 d-1)，光照下的降解速率明显大于黑暗条件，高有机质组的降解速率明显高于低有机质组(光照：0.118 d-1(高有机质)vs0.069 d-1(低有机质)；黑暗：0.065 d-1(高有机质)vs0.041 d-1(低有机质))，这表明高温、光照及高有机质浓度均有利于磺胺甲恶唑的降解。
　　 采用抗性平板筛选可培养的耐药细菌，耐药率的动力学变化表明，高温(20℃)及高有机质有利于可培养耐药细菌的生长，光照条件下耐药率呈消减趋势，这与DGGE的结果一致，抗生素添加浓度为20mg/L组DGGE实验表明，高温(20℃)及高有机质促进耐药微生物的多样性生长，光照条件对耐药微生物多样性影响不明显。16S r-DNA基因序列分析鉴定出底泥中的优势可培养耐药菌芽孢杆菌属(Bacillus)，不用温度、光照及有机质下优势耐药菌的具体种类有所不同，如4℃下优势耐药菌为耐寒短杆菌(friqoritolerans)及坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，20℃黑暗条件下为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、E海黄芽孢杆菌(Bacillus marisflavi)。DGGE条带位置的明显差异也表明不同温度、光照及有机质下耐药微生物群落结构差异明显。
　　 采用PCR方法对模拟体系底泥中的磺胺抗性基因进行定性检测，并通过Real-time PCR对两种磺胺类抗性基因(sul1，sul2)及总细菌的16S r-DNA进行定量分析。抗生素加入组sul基因的相对丰度(sul/16S r-DNA)较对照组均有所增加，表明抗生素对抗性基因的环境选择性压力。20℃下sul1/16S r-DNA，sul2/16Sr-DNA均明显高于4℃，高有机质组明显高于低有机质组，且sul2/16S r-DNA的增幅更明显，表明高温(20℃)及高有机质条件有利于sul的传播扩散，尤其是sul2的传播扩散。无论抗生素添加与否，光照条件对sul基因消长的影响不明显，光照下抗生素SMX的快速光解并没有直接影响到抗生素对抗性基因的选择，抗生素对抗性基因的选择具有延后性。