铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性相关基因PA4735功能的研究

摘要

铜绿假单胞菌是一种广宿主条件致病菌，是一种可以引起严重医院内获得性感染的常见病原菌，在临床上常引起难治性和顽固性感染。众多毒力因子的产生和存在是铜绿假单胞菌具有感染性和致病性的重要因素，而弹性蛋白酶是其重要的毒力因子之一。本研究以一株临床分离株P． aeruginosa PA68为原始菌株，利用Mu转座重组技术构建了P．aeruginosa PA68突变子文库。从文库中筛选得到一株水解弹性蛋白能力缺陷的突变株M44。
　　 对突变株M44通过基因克隆、核苷酸序列分析，确定了Mu在基因组上的插入位点为PA4735基因。PA4735I基因属于Ⅳ类基因，基因全长3267bp，编码1088个氨基酸，定位于细胞质膜。其上下游基因PA4734和PA4736都是功能完全未知的Ⅳ类基因。本文分别从正反两方面，使用遗传互补、同源重组方法对PA4735的功能进行测定。目前敲除株尚未得到，表型上得到了部分互补，正在进行验证。
　　 为了研究PA4735基因在调控弹性蛋白酶表达过程中的途径和该基因在群体密度感应系统中的地位和作用，本文构建了三个群体密度感应系统相关基因及弹性蛋白酶结构基因的融合质粒。通过检测报告基因的表达分析PA4735基因的失活产生对其它基因转录水平的影响。PA4735基因的突变，抑制了lasB基因的转录水平。PA4735 mutant中lasI,vqsR的转录水平分别比野生型菌株中的转录水平大幅下降了。推测PA4735基因很有可能通过调控vqsR、lasI的QS环路从而调控lasB基因的转录。同时表明在突变株M44中，弹性蛋白酶活性的降低是由于弹性蛋白酶结构基因lasB的转录水平受到抑制引起的，同时表明PA4735是一个群体密度感应系统的正向调控因子，而且突变株中PA4735基因的插入失活导致了vqsR基因和lasI基因的转录效率的降低。因而我们认为PA4735通过正向调控las系统调控毒力因子的表达。
　　 综上所述，PA4735是一个参与到铜绿假单胞菌群体密度感应系统中与水解弹性蛋白相关的基因。