Snfl蛋白激酶在新型隐球酵母致病性中的作用研究

摘要

新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans），是广泛存在于环境中的担子菌酵母，并已成为临床常见的主要真菌病原体之一。与新型隐球酵母致病因子调控相关的分子机制阐述对临床治疗隐球菌病具有重要指导意义。在本文中，我们主要进行了Snfl蛋白激酶(SNF1蛋白激酶复合体催化亚基蛋白)对新型隐球酵母致病因子生物合成的调控功能鉴定以及相关分子机制的揭示；并通过研究发现，该蛋白在参与细胞壁完整性的维持、细胞形态的发生以及细胞的压力应答反应中均起到重要调控作用。论文主要包括下面三个部分的内容：
　　 第一部分：新型隐球酵母Snfl蛋白激酶参与致病因子生物合成的分子机制研究本文根据同源重组的原理进行基因定向敲除，破坏了编码新型隐球酵母血清型D菌株SNF1蛋白激酶复合体催化亚基蛋白（Snfl蛋白激酶）的SNF1基因，成功构建了snf77突变的菌株snf1。通过表型分析和细胞学等实验发现snf1△的表型非常丰富。该突变菌株的丰富表型充分表明SNF1参与细胞对不同碳源的利用以及细胞对热激、正离子压力的应答反应。通过墨汁负染显微观察发现该突变菌株荚膜的生物合成能力降低：黑色素产生实验表明该突变菌株的漆酶表达能力也大大降低。通过BALB/c小鼠隐球菌病模型实验发现，与野生型菌株和回补菌株相比，snfl-突变菌株显示出明显降低的细胞毒性。以上结果表明SNF1通过控制致病因子的表达来调控着细胞的致病能力。
　　 前期研究发现，葡萄糖饥饿是诱导新型隐球酵母漆酶表达的重要调节因子，但是相关的分子机制尚不清楚。在本文中，我们发现铵盐是协同葡萄糖饥饿条件诱导新型隐球酵母漆酶表达的必须因素。通过黑色素表型检测实验、反转录PCR(RT-PCR)以及漆酶活性测定实验发现，JEC21中编码漆酶的基因CNLAC1以及SNF1的转录依赖于铵盐的浓度：在低葡萄糖环境下，随着铵盐浓度的不断提高，CNLAC1和SNF1的转录表达均能被诱导。在snflz5中，铵盐不能协同葡萄糖饥饿环境诱导细胞漆酶基因的转录，致使突变菌株细胞的漆酶活性和黑色素产生能力受到破坏，表明隐球酵母JEC21中，铵盐协同葡萄糖饥饿诱导漆酶表达受到SNF1基因的调控。这些重要结论的获得，加深了我们对漆酶表达调控的分子机制的理解。
　　 第二部分：新型隐球酵母Snf1蛋白激酶对细胞形态发生的调控作用通过表型测定实验发现snf1△对细胞壁抑制剂十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecyl sulfate，SDS)等非常敏感，进而说明了该突变菌株的细胞壁完整性受到了破坏。通过大批量的RT-PCR检测发现，SNF1能够影响细胞壁完整性是通过对细胞壁组分B-1，6葡聚糖合成相关蛋白的基因转录表达调控实现的。该基因突变株还表现出异常的细胞分离现象，其对热激敏感的表型能够通过外源渗透压稳定剂山梨醇的加入而得到恢复。这些结果证明了SNF1对细胞壁完整性维持的重要调控作用，该调控作用也会间接地影响到热激条件下的细胞生存能力。
　　 我们通过系统的研究发现，不同碳源、氮源和其他环境因素能够决定新型隐球酵母细胞体外侵袭性生长(Invaslve growth)。SNF1对细胞在低葡萄糖条件下的体外侵袭性生长具有重要调控作用，且该作用依赖于葡萄糖饥饿条件的存在以及c削汩信号通路的调控。另外，SNF1对细胞的有性生殖发生也存在重要调控，且该调控不依赖于铜离子诱导作用以及cAMP信号通路。以上结论为SNF1对细胞形态发生重要调控功能的深入研究做了铺垫。
　　 第三部分：与SNF1调控相关的转录组(RNA-Seq)分析揭示新型隐球酵母SNF1蛋白激酶信号通路的调控模式及新的功能通过深度测序技术RNA-Seq，分析野生型菌株JEC21和突变菌株snf1A的转录组区别，我们发现新型隐球酵母SNF1信号通路主要影响与细胞营养及能量代谢相关的基因表达，同时它还影响编码核糖体蛋白及RNA降解相关蛋白的基因表达，为研究SNF1蛋白激酶信号通路的功能提供了新的方向。