幽门螺杆菌UreB抗原与CTB在蚕蛹中的融合表达及免疫原性研究

摘要

幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素，目前的治疗手段主要是应用抗生素治疗的三联疗法和四联疗法，但是随着菌体抗生素抗性的增加，治愈率明显降低，免疫治疗可能是有效防治幽门螺杆菌感染最有前景的方法之一，幽门螺杆菌疫苗的研制已经成为目前研究的热点。家蚕生物反应器主要是利用家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白，因其低成本、高表达量、产物天然性好而著称。本文旨在利用家蚕生物反应器表达CTB免疫佐剂和幽门螺杆菌UreB抗原融合蛋白，并对其免疫原性进行研究，为利用家蚕生物反应器低成本生产幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。
　　 首先，对重组杆状病毒BmNPV-UreB中ureB基因进行了序列测定，SDS-PAGE和Western blotting分析显示重组病毒在家蚕BmN细胞、幼虫和蚕蛹中能稳定表达；利用AKTA explorer10蛋白纯化系统对家蚕幼虫血淋巴中的UreB蛋白进行阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，经双向电泳进一步分离后进行了质谱鉴定。其次，采用原核表达系统表达了CTB蛋白，GM1亲和活性分析表明表达的CTB蛋白具有较好的GM1亲和活性，可以作为口服免疫佐剂。第三，利用Bac-to-Bac系统构建了重组病毒BmNPV-(CTB-Linker-UreB)，对CTB和ureB基因进行了融合表达，SDS-PAGE和 Western blotting分析显示重组杆状病毒在家蚕BmN细胞和蚕蛹中成功表达；利用抗体亲和层析对蚕蛹表达的CTB-Linker-UreB融合蛋白进行了纯化并进行了质谱鉴定。最后，用蚕蛹表达的CTB-Linker-UreB融合蛋白灌胃ICR小鼠探讨了该融合蛋白的口服免疫原性。实验结果显示，融合蛋白能够明显诱导小鼠产生血清IgG，表明融合蛋白具有较好的免疫原性，可以作为生产幽门螺杆菌口服疫苗的候选抗原蛋白。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 引言

第一节 家蚕杆状病毒及其表达系统概述

1.1.1 家蚕杆状病毒的分子生物学特征

1.1.2 现阶段家蚕杆状病毒表达系统的研究状况

1.1.3 家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白的优势

第二节 幽门螺杆菌疫苗研究进展

1.2.1 幽门螺杆菌主要抗原蛋白

1.2.2 现阶段已进入临床试验的Hp疫苗

第三节 黏膜免疫佐剂研究进展

1.3.1 细菌毒素

1.3.2 寡聚脱氧核苷酸CpG序列

1.3.3 细胞因子

1.3.4 微生物菌体

1.3.5 单磷酸类脂A

第四节 实验设计

1.4.1 研究目的与意义

1.4.2 研究内容

1.4.3 实验方案

第二章 重组家蚕杆状病毒BmNPV-UreB的复苏及鉴定

第一节 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 试剂

2.1.3 试剂的配制

第二节 实验方法

2.2.1 家蚕细胞冻存与复苏

2.2.2 重组杆状病毒BmNPV-UreB的复苏

2.2.3 重组杆状病毒BmNPV-UreB中ureB基因的测序

2.2.4 重组杆状病毒BmNPV-UreB在BmN细胞的表达分析

2.2.5 重组杆状病毒BmNPV-UreB病毒滴度测定

2.2.6 重组杆状病毒BmNPV-UreB在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达分析

2.2.7 家蚕幼虫血淋巴中UreB蛋白的纯化及质谱鉴定

第三节 实验结果与分析

2.3.1 重组杆状病毒BmNPV-UreB中ureB基因的测序结果

2.3.2 重组杆状病毒BmNPV-UreB在BmN细胞的表达分析

2.3.3 重组杆状病毒BmNPV-UreB病毒滴度分析

2.3.4 重组杆状病毒BmNPV-UreB在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达分析

2.3.5 UreB蛋白纯化及质谱鉴定结果

第三章 黏膜免疫佐剂CTB蛋白的原核表达纯化

第一节 材料与试剂

3.1.1 材料

3.1.2 试剂

3.1.3 试剂的配制

第二节 实验方法

3.2.1 CTB基因的PCR扩增

3.2.2 双酶切反应

3.2.3 双酶切产物的纯化

3.2.4 连接反应

3.2.5 连接产物的转化

3.2.6 阳性克隆的筛选与测序

3.2.7 重组质粒转化表达菌

3.2.8 重组质粒的诱导表达

3.2.9 CTB重组蛋白的表达检测

3.2.10 CTB重组蛋白的纯化

3.2.11 CTB重组蛋白的TEV酶切

3.2.12 酶切后纯化的CTB蛋白的GM1亲和活性测定

3.2.13 CTB多克隆抗体的制备

第三节 实验结果与分析

3.3.1 CTB基因的PCR扩增结果

3.3.2 重组质粒pET-32a-CTB的鉴定

3.3.3 重组质粒pET-32a-CTB测序结果

3.3.4 重组CTB蛋白的表达及纯化

3.3.5 重组CTB蛋白的TEV酶切结果

3.3.6 酶切后纯化的CTB蛋白的GM1亲和活性

3.3.7 CTB多克隆抗体兔血清鉴定

3.3.8 CTB多克隆抗体兔血清效价

第四章 家蚕杆状病毒表达系统中CTB与UreB的融合表达

第一节 材料与试剂

4.1.1 材料

4.1.2 试剂

4.1.3 试剂的配制

第二节 实验方法

4.2.1 CTB-Linker-UreB融合蛋白的三级结构预测

4.2.2 CTB-linker-ureB融合基因的获得

4.2.3 重组质粒pFast BacTM-(CTB-linker-ureB)的构建

4.2.4 重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-UreB)的构建

4.2.5 CTB-Linker-UreB融合蛋白在家蚕细胞的表达

4.2.6 病毒滴度测定

4.2.7 CTB-Linker-UreB融合蛋白在蚕蛹中的表达及检测

4.2.8 CTB-Linker-UreB融合蛋白的纯化

4.2.9 CTB-Linker-UreB融合蛋白的质谱鉴定

第三节 实验结果与分析

4.3.1 CTB-Linker-UreB融合蛋白的三级结构预测结果

4.3.2 CTB-linker-ureB融合基因的获得

4.3.3 重组质粒pFast BacTM1-(CTB-linker-ureB)的构建结果

4.3.4 重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-UreB)的构建结果

4.3.5 CTB-Linker-UreB融合蛋白在家蚕细胞的表达分析结果

4.3.6 病毒滴度测定结果

4.3.7 CTB-Linker-UreB融合蛋白在蚕蛹中的表达分析结果

4.3.8 CTB-Linker-UreB融合蛋白的纯化结果

4.3.9 CTB-Linker-UreB融合蛋白的质谱鉴定结果

第五章 蚕蛹表达的CTB-Linker-UreB融合蛋白的免疫原性研究

第一节 材料与试剂

5.1.1 材料

5.1.2 试剂

5.1.3 试剂的配制

第二节 实验方法

5.2.1 免疫抗原制备

5.2.2 小鼠口服免疫分组

5.2.3 免疫方法

5.2.4 小鼠血清中抗体滴度测定

第三节 实验结果与分析

5.3.1 小鼠血清中抗体滴度分析

第六章 结论

参考文献

致谢

附录A ureB基因测序结果及预测的氨基酸序列

附录B CTB基因测序结果及预测的氨基酸序列

附录C CTB-linker-ureB融合基因测序结果及预测氨基酸序列

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果