声明
摘要
符号说明
第一章 绪论
第一节 流感病毒的爆发历史以及现状
第二节 流感病毒的相关知识
第三节 流感病毒RNA聚合酶的相关知识
第四节 国内外抗流感药物的研究现状
1．4．1 流感疫苗
1．4．2 抗流感药物
第五节 选择流感聚合酶PA_N为靶点的优势
第六节 课题研究的意义和目标
第二章 实验方案的设计
第一节 实验方案的总体策略
第二节 建立高通量筛药体系
第三节 基于小分子片段库和天然产物库筛选抑制剂
2．3．1 基于小分子片段库筛选抑制剂
2．3．2 基于天然产物库筛选抑制剂
第四节 基于蛋白质三维结构抑制剂的筛选和验证
第五节 细胞水平有活性抑制剂的验证
第三章 流感病毒RNA聚合酶PA亚基(PA_N基因)的克隆与表达纯化与结晶
第一节 材料和试剂
3．1．1 材料
3．1．2 试剂与仪器
3．1．3 主要试剂的配置
第二节 方法
3．2．1 重组质粒pGEX-6P-1-PA_N的构建
3．2．2 目的基因聚合酶链式反应(PCR)扩增
3．2．3 目的基因与载体连接
3．2．4 将连接产物转化感受态细胞
3．2．5 PA_N蛋白的表达与纯化
3．2．6 PA_N蛋白结晶
第三节 实验结果
3．3．1 PCR扩增完整的目的基因序列
3．3．2 重组质粒pGEX-6P-1-PA_N的菌落PCR鉴定结果
3．3．3 重组质粒pGEX-6P-1-PA_N的双酶切鉴定鉴定结果
3．3．4 重组质粒测序结果
3．3．5 重组融合蛋白在原核表达系统中的诱导表达
3．3．6 重组蛋白PA_N表达结果
3．3．7 重组蛋白纯化结果
3．3．8 重组蛋白晶体图
第四节 讨论
第四章 高通量荧光筛药体系
第一节 材料和试剂
4．1．1 实验材料
4．1．2 实验试剂
4．1．3 主要试剂
第二节 实验方法和具体步骤
4．2．1 剩余活性的检测
4．2．2 荧光淬灭的检测
第三节 实验结果及分析
4．3．1 剩余活性的曲线
4．3．2 荧光淬灭的曲线
第四节 琼脂糖核酸胶筛选体系
第五节 小结
第五章 细胞水平的验证
第一节 材料与试剂
5．1．1 材料
5．1．2 试剂
5．1．3 试剂配制
第二节 实验方法
5．2．1 MDCK细胞的培养
5．2．2 流感病毒滴度的测试
5．2．3 药物毒性的测试
5．2．4 细胞水平IC50值的测定
第三节 实验结果
5．3．1 药物毒性
5．3．2 病毒滴度
5．3．3 细胞水平IC50值的测定
第四节 讨论
第六章 高通量抑制剂的筛选结果
第一节 小分子片段库的筛选情况
6．1．1 小分子片段化合物库筛选筛选出11种抑制效果比较好的小分子片段
6．1．2 4-羰基-2-丁烯酸类化合物
第二节 天然产物库的筛选情况
6．2．1 天然产物库筛选
6．2．2 中药单体库筛选
6．2．3 从天然混合库中筛选分离出有活性化合
第三节 琼脂糖核酸电泳筛药结果
第四节 蛋白晶体泡药结果
第五节 细胞水平验证情况
第六节分析与讨论
第七章 结论与后续工作
参考文献
蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12(Protein Tyrosine Phosphatomenon-receptor type 12)表达纯化及晶体结构
致谢
个人简历
