重要病毒蛋白对双链RNA依赖性激酶PKR抑制作用的体外分析

摘要

双链RNA依赖的蛋白激酶PKR属于丝/苏蛋白激酶亚家族成员，它被激活后会形成同源二聚体，发生自身磷酸化，随后将其底物磷酸化，在细胞信号转导及细胞生长、分化、凋亡过程中发挥重要作用。其中PKR最突出的作用是在天然免疫方面，例如病毒感染宿主细胞后，通过磷酸化eIF2α来抑制mRNA的翻译，引起蛋白合成终止。为了抵御宿主这种免疫调控，病毒进化出相应策略来抑制该过程：其中流感病毒NS1蛋白可以抑制PKR的激活，Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP34.5则能够介导eIF2α脱磷酸化。为了探明这种机制，我们对这些病毒蛋白与PKR、eIF2α的相关作用进行了初步研究。
　　 本论文研究中利用原核细胞大肠杆菌表达重组蛋白、并通过亲和层析和离子交换层析等技术手段纯化了PKR、eIF2α和禽流感NS1蛋白，建立了体外检测PKR活性和eIF2α脱磷酸化作用的实验体系，并检测了高致病性禽流感病毒的NS1蛋白和HSV-1的ICP34.5对其相关影响。实验表明：在体外，NS1蛋白能够抑制PKR的活性，HSV-1的ICP34.5能够介导真核eIF2α的脱磷酸。此外，我们还发现NS1蛋白的聚合状态与核酸相关，并可能对PKR的活性产生影响；原核细胞表达的eIF2α在体外反应中只能被磷酸化，而不能被脱磷酸化，推测可能缺少某种修饰或辅助因子。
　　 本文利用生物化学手段初步研究了病毒蛋白NS1、ICP34.5对于PKR、eIF2α功能作用的影响，为深入研究宿主对病毒的免疫调控提供了线索和量化基础。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 引言

第一节 PKR蛋白简介

1.1.1 PKR结构与激活机制

1.1.2 PKR的生物功能

1.1.3 PKR与病毒间的关系

第二节 流感病毒与NS1蛋白

1.2.1 流感病毒简介

1.2.2 NS1非结构蛋白

第三节 单纯疱疹病毒与ICP34.5

1.3.1 单纯疱疹病毒简介

1.3.2 ICP34.5蛋白简介

第二章 材料与方法

第一节 材料与试剂

2.1.1 质粒，菌株和细胞系

2.1.2 实验试剂与引物

2.1.3 主要试剂配方

2.1.4 主要仪器

第二节 实验原理及方法

2.2.1 分子克隆方法

2.2.2 蛋白质检测方法

2.2.3 细胞培养及转染

2.2.4 蛋白纯化技术

2.2.5 S2果蝇细胞表达系统的建立

第三章 实验结果

第一节 禽流感NS1蛋白对PKR活性影响的初步研究

3.1.1 PKR和eIF2α的纯化

3.1.2 PKR对eIF2α磷酸化体系的建立和检测

3.1.3 NS1蛋白的纯化与分析

3.1.4 NS1蛋白对PKR活性影响的研究

第二节 HSV-1病毒的ICP34.5对eIF2α脱磷酸化作用的研究

3.2.1 对从原核细胞纯化得到的eIF2α脱磷酸化的研究

3.2.2 对从真核细胞得到的eIF2α脱磷酸化的研究

第三节 eIF2α真核表达载体的构建和蛋白表达纯化

3.3.1 eIF2α真核表达载体的构建

3.3.2 真核eIF2α的表达和纯化

第四章 结果与讨论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果