门多萨假单胞菌NK-01生物合成褐藻寡糖和PHAMCL及其代谢途径改造

摘要

本研究以门多萨假单胞菌NK-01(Pseudomonas mendocina NK-01)为菌种，研究了其利用非相关性碳源如：葡萄糖，发酵生产中长链聚羟基脂肪酸酯(Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates，PHAMCL)和褐藻寡糖(AlginateOligosaccharides，AO)。同时，对双产物进行了结构鉴定和物理性能表征。其次，利用基因敲除技术阻断PHAMCL的合成途径，使得褐藻寡糖的产量增加，对双产物的代谢竞争关系进行了探讨。最后，对PHA合成酶PhaC1和PhaC2的底物特异性进行了研究。
　　 200 L发酵实验表明，P.mendocina NK-01经过48 h的发酵，最终能够积累0.316 gL-1PHAMCL和0.57 g-1AO。P.mendocina NK-01是第一株能够利用葡萄糖直接合成AO的微生物。通过1H、13C核磁共振(NMR)、傅里叶红外光谱分析(FT-IR)、气相色谱.质谱联用(GC-Mass)以及凝胶渗透色谱(GPC)等分析手段对合成的AO和PHAMCL进行结构分析。结果表明，褐藻寡糖主要由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid，G)这两种单体组成。并且在单体的C-2或者C-3有部分乙酰化。GPC测定结果表明，AO主要由两个组份所组成，重均分子量分别为1546和1029 Da。而对PHAMCL的分析表明，它主要的组成单体是3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate，3HO)和3-羟基癸酸(3-hydroxydecanoate，3-HD)，而另外五种单体3-羟基己酸(3-hydroxyhexanoate，3-HHx)、3-羟基十二烷酸(3-hydroxydodecanoate，3-HDD)、3-羟基十四烷酸(3-hydroxytridecanoate，3-HTD)、3-羟基十六烷酸(3-hydroxyhexadecanoate，3-HHD)以及3-羟基十八烷酸(3-hydroxyoctadecanoate，3-HOD)只占组成单体的很小比例。通过示差扫描量热法分析(DSC)表明，PHAMCL的熔融温度(Tm)和玻璃化转变温度(Ta)分别为51.03℃和-41.21℃。热重分析(TG)表明，PHAMCL的热分解温度(Td)约为300℃。因此，该PHA的温度加工范围很宽。拉伸力学(Tensile Testing)试验表明在12 MPa压力下PHAMCL的断裂伸长率为700％，是一种粘弹性的高分子材料。X射线衍射分析(XRD)表明，PHAMCL具有很低的结晶度。
　　 由于P.mendocina NK-01能够同时合成PHAMCL和AO，推测若阻断PHAMCL的合成途径，是否能够使得AO的产量得到增加。利用PCR技术对P.mendocinaNK-01 PHAMCL合酶基因操纵子进行克隆，该合酶属于二型PHA合成酶，整个操纵子大小为4.5 kb，两个合酶基因大小均为1.7 kb，中间被一个大小为0.85 kb的降解酶基因分隔开。将这三个开放阅读框序列分别提交至GenBank，分别获得登录号：phaC1(DQ316602.1)、phaZ(HM585027.1)phaC2(EU580408.1)。利用自杀质粒pEX18Tc对NK-01合成酶操纵子进行敲除，大约57％的操纵子基因被敲除掉，获得突变体P.mendocina C7。通过PCR和抗性实验对突变体Pmendocina C7进行验证，结果表明，P.mendocina C7是PHA合成酶敲除突变体。摇瓶和30 L发酵罐实验表明，经过48 h发酵，突变体P.mendocina C7合成AO的产量分别是野生菌的2.21倍和2.64倍，且在突变体中检测不到PHAMCL的合成。利用MS和GPC对突变体合成的AO的品质分析表明，它所合成的产物在单体组成和分子量方面与野生菌是一致的。以上实验表明，在P.mendocina NK-01中，AO和PHAMCL具有代谢上的竞争关系。此前，只有文献报道在铜绿假单胞菌中，PHAMCL的合成和褐藻多糖的合成具有代谢上的竞争关系，而我们的实验表明AO和PHAMCL具有代谢上的竞争关系。由此，我们推测在P.mendocinaNK-01的胞外能够分泌褐藻多糖降解酶，将合成的褐藻多糖降解为AO。
　　 由于获得AO的高效生产菌需要敲除PHA合成酶操纵子，因此获得的突变株是PHA合成缺陷株，可以用于PHA合成酶基因phaC1和phaC2的功能研究。P.mendocina NK-01合成的PHA单体以3HO和3HD为主，因此阐明是野生菌中PhaC1和PhaC2中的哪个合成酶在对PHA的合成起主要作用，阐明PhaC1和PhaC2的底物偏好性，从而可控地合成一些不同单体组成和含量的PHAMCL将具有重要意义。我们将phaC1和phaC2分别克隆到表达载体pBBR1MCS-2构建pBBR1MCS-C1和pBBR1MCS-C2，并将这两个质粒分别转化PHAMCL合成缺陷株P.mendocina C7。分别将得到的两株基因工程菌命名为P.mendocina C7C1相P.mendocina C7C2。对它们进行摇瓶发酵实验并提取PHA，从而对PhaC1和PhaC2合成PHA的产率进行比较，同时对所合成的PHA的单体组成、分子量及物性等方面进行表征。表征时所使用的手段有GC/MS、GPC、DSC、TGA和XRD。结果表明，PhaC1的活性比PhaC2更高以致于可以合成更多的PHAMCL，但是所合成的PHAMCL的分子量较低。GC/MS分析表明，PhaC1和PhaC2所合成的PHAMCL在单体组成方面具有极高的相似性，这两个酶都偏好以3HD-CoA为底物。DSC、TGA和XRD的结果也表明PhaC1和PhaC2所合成的PHAMCL具有相似的物理性质。单体的组成决定所合成的PHAMCL的性质，由于所有的结果都表明，PhaC1和PhaC2所合成的PHAMCL在单体组成和物性方面具有相似性，因此，P.mendocina NK-01的PhaC1和PhaC2具有相同的底物偏好性。该结论此前在假单胞菌属(Pseudomonas)里未见报道。