周围神经Wallerian变性对干细胞归巢/迁移的动员作用及趋化性再生的潜在分子机制

摘要

目的:在建立大鼠周围神经损伤模型的基础上，研究Wallerian变性与干细胞归巢之间的关系，周围神经损伤后干细胞向神经断端归巢的现象及潜在机制，以及干细胞归巢后的转归，为周围神经损伤的修复探索新的思路。利用蛋白组学技术建立感觉神经和运动神经的双向电泳(2-DE)图，比较周围感觉神经和运动神经内蛋白质的表达差异，为周围神经损伤后趋化性再生的机制研究提供依据。
　　 方法:
　　 1.使用PCR，Western blot，免疫荧光等方法鉴定趋化因子SDF-1在Wallerian变性的损伤神经远端及其特异性受体CXCR4在BMSCs中的表达情况。
　　 2.用Transwell细胞迁移模型，检验离断后发生Wallerian变性的远端神经组织匀浆对BMSCs迁移的趋化作用，使用SDF-1/CXCR4轴特异性阻断剂AMD3100检验SDF-1在其中扮演的角色。
　　 3.通过向大鼠坐骨神经切断/吻合模型的尾静脉注射移植表达RFP的BMSCs，模拟BMSCs向神经组织归巢的过程，使用荧光成像和病理学方法观察BMSCs是否通过机体血液循环归巢至损伤的神经组织局部，并进一步使用特异性阻断剂AMD3100验证SDF-1/CXCR4轴对BMSCs归巢的动员机制。
　　 4.建立大鼠坐骨神经节段性冰冻损伤和CEANA修复节段性缺损两种模型，将表达RFP的BMSCs添加到损伤的神经组织周围，观察BMSCs在神经损伤局部的迁移对神经修复的促进效果并探索其作用机制，重点观察干细胞在神经微环境中的分化和转归。
　　 5.正常雌性Wistar大鼠，深度麻醉后取双侧隐神经及股神经肌支，打开椎管及硬脊膜，显微镜下分离取出背侧神经根及腹侧神经根，分别提取蛋白质。在蛋白质充分匀浆、超声裂解并定量后，在相同条件下，对每组蛋白质样品进行3次双向电泳，对重复3次实验的隐神经与股神经肌支，背侧神经根与腹侧神经根两两进行分析，比较两对感觉和运动神经电泳图中的蛋白质表达的变化。将差异表达的蛋白质点从凝胶上切下来并溶解为多肽，使用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(nanoUPLC-nano-ESI-MS/MS)进行分析，根据所得的质谱数据通过Mascot搜索引擎进行蛋白质查询鉴定。
　　 结果:
　　 1.切断后1d、3d和7d组发生Wallerian变性的远端组织SDF-1在mRNA的表达均明显高于正常对照组。CXCR4在分离培养扩增后的BMSCs和表达RFP的BMSCs中均稳定表达。
　　 2.Wallerian变性的神经远端组织匀浆可以在体外Transwell模型中吸引BMSCs的迁移，该趋化作用可以被SDF-1/CXCR4轴AMD3100阻断。
　　 3.尾静脉注射RFP-BMSCs向切断并吻合后发生Wallerian变性的神经组织局部迁移。Wallerian变性的神经对BMSCs的趋化作用，可以被SDF-1/CXCR4轴阻断剂AMD3100阻断。
　　 4.在节段性冰冻损伤神经或移植的CEANA内部或周围移植RFP-BMSCs后12周，再生神经纤维间均有RFP-BMSCs分布，并显示Nestin、S100、P0阳性。在节段性冰冻损伤的神经、桥接节段性神经缺损的CEANA内注射或周围局部添加BMSCs，可以提高小腿三头肌收缩力和湿重的恢复率，缩短CMAPs潜伏期，增高CMAPs波幅，增加神经有髓纤维密度以及髓鞘的厚度，促进周围神经损伤修复。
　　 5.应用双向电泳体系，成功建立周围感觉神经和运动神经蛋白质组双向电泳图谱，隐神经与股神经肌支，背侧神经根与腹侧神经根等四种神经双向电泳图蛋白匹配率均>80％。通过比较双向电泳图，共计有13个蛋白质斑点在隐神经与股神经肌支的蛋白质组中差异表达，其中隐神经表达水平较股神经肌支高的有8个点，股神经肌支较隐神经表达水平高有5个点；共计有16个蛋白质斑点在腹侧神经根组与背侧神经根组表达差异，其中背侧神经根较腹侧神经根表达水平高的有6个点，表达水平低的有10个点。将选取的29个蛋白差异点进行nanoUPLC-nano-ESI-MS/MS分析得到质谱数据并在Mascot搜索引擎中查询并排除角蛋白污染后，共成功鉴定隐神经与股神经肌支的11个蛋白差异点(涉及7种蛋白)，以及腹侧神经根与背侧神经根的9个蛋白差异点(涉及7种蛋白)。
　　 结论:
　　 Wallerian变性的周围神经组织在体内和体外，对BMSCs均有趋化动员作用。SDF-1/CXCR4轴在Wallerian变性神经组织对BMSCs的趋化动员过程中发挥重要作用。
　　 在节段性损伤的神经或桥接节段性神经缺损的CEANA周围局部添加BMSCs，BMSCs可以迁移到再生神经内，并向神经干细胞及雪旺细胞方向分化，通过促进髓鞘再生和引导轴索生长，达到与直接向神经内注射BMSCs相当的修复效果。
　　 成功构建大鼠周围感觉神经与运动神经双向电泳图，并联合使用质谱技术鉴定了其中的大部分蛋白质。这些蛋白质有可能成为区分感觉和运动神经的特异性标记，同时可能在周围神经损伤后的趋化性再生过程中发挥重要作用。