人胚胎干细胞来源内皮细胞作为细胞载体对转移性乳腺癌进行靶向治疗的研究

摘要

目前，乳腺癌已经成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤之一。在当前条件下，其原发肿瘤病灶可以通过手术进行根治，而乳腺癌所发生的转移成为了患者的重要死因。肺转移是乳腺癌最为常见的转移类型之一，多见双肺多发转移，为手术切除造成了很大困难，目前多应用化疗进行治疗。然而大多数化疗药物并不能够特异性地作用于肿瘤细胞，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生一定杀伤作用，从而产生毒副作用，如恶心、脱发等。如果能够找到一种靶向多发肿瘤灶的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响，将显著提高治疗效果，减低毒副作用。
　　 肿瘤的生长和转移在很大程度上依赖于血管新生。有证据表明，骨髓来源的内皮前体细胞参与了肿瘤血管的生成。除去自体的内皮前体细胞，外源内皮前体细胞通过静脉注射也可以聚集于肿瘤生长部位。利用改造后的内皮前体细胞作为载体进行抗肿瘤治疗的效果已经被多项研究证明。然而，从成体组织中分离得到的内皮前体细胞数量有限，且其来源不易获得，这就阻碍了将其应用于临床治疗，所以有必要找到其它同样具有肿瘤靶向性的细胞来作为肿瘤靶向基因治疗的载体。
　　 因为具有无限的自我复制能力和全能性，人胚胎干细胞(human embryonicstem cells，hESCs)能够通过在体内或体外分化为大量的成体细胞而成为细胞治疗的有效来源。有大量证据表明不同分化阶段的人胚胎干细胞能够被诱导成为内皮细胞，这提示人胚胎干细胞来源内皮细胞能否代替成体内皮前体细胞作为细胞载体用于转移性乳腺癌的治疗。
　　 本课题首先应用人胚胎干细胞H9细胞系获得出芽类胚体，流式分选CD31/CD144双阳性细胞，即人胚胎干细胞来源内皮细胞(human embryonic stem
　　 cell-derived endothelial cells，hESC-ECs)。收集hESC-ECs的条件培养基(EC-CM)刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞，观察肿瘤细胞的增殖和转移能力。经过EC-CM处理的MDA-MB-231细胞生长速度明显减缓，处于G1期的细胞比例升高，处于S期、G2/M期细胞比例下调，并且在低血清培养条件下细胞凋亡的比例升高；MDA-MB-231细胞经过EC-CM处理后迁移能力下降，间充质标志物α-SMA和fibronectin表达下调，上皮标志物ZO-1表达上调并在细胞表面表达；并且，处理后的MDA-MB-231细胞β-catenin表达下调。
　　 为了检测hESC-ECs的肿瘤靶向性，我们向雌性NOD/SCID免疫缺陷小鼠经尾静脉注射了1.5×106个MDA-MB-231细胞建立乳腺癌肺转移小鼠模型。模型建立后，向荷瘤小鼠经尾静脉注射1.0×106个表达绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)-萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FLuc)双融合蛋白的hESC-ECs(EC-BF细胞)，并应用活体成像技术观察注射后的EC-BF细胞在小鼠体内的分布，发现EC-BF细胞能够特异性地聚集于肺部肿瘤转移灶大于72小时，具有肿瘤靶向性。
　　 为了获得可以进行活体成像并携带自杀基因的hESC-ECs，首先将海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-胸苷激酶片断(RL-RFP-HSV-ttk)连接进慢病毒表达载体pLV-EF1α-MCS-IRES-Bsd中，获得pLV-EF1α-TF-Bsd，再用其转染hESC-ECs得到表达海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-胸苷激酶三融合蛋白的hESC-ECs(EC-TF细胞)。并且在体外验证了胸苷激酶的前药更西洛韦(GCV)对EC-TF细胞的杀伤作用，以及在给予GCV的情况下EC-TF细胞对共培养的MDA-MB-231细胞通过“旁观者效应”造成的杀伤作用。
　　 最后，应用可以通过萤火虫荧光素酶活体成像评估肿瘤生长情况的乳腺癌肺转移小鼠模型评估EC-TF细胞用于转移性乳腺癌治疗的可能性，发现经静脉注射的EC-TF细胞能够明显抑制已经形成的肿瘤转移灶生长，并且在给予GCV的情况下能够增强这种抑制作用。
　　 通过上述实验，可以得到以下主要结论：人胚胎干细胞来源内皮细胞能够通过旁分泌作用，通过可分泌性细胞因子作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制其Wnt/β-catenin通路，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和转移能力；经过静脉注射的人胚胎干细胞来源内皮细胞能够特异性地聚集于NOD/SCID免疫缺陷小鼠肺部乳腺癌转移灶超过72小时，具有肿瘤靶向性；人胚胎干细胞来源内皮细胞能够稳定表达海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-胸苷激酶三融合蛋白，并且更西洛韦对这种表达三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞具有强杀伤作用；在给予更西洛韦的情况下，表达三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞经静脉注射后能够通过旁观者效应明显抑制乳腺癌肺部转移灶的生长。