X染色体调控元件的定位及DNA亲和纯化技术的探索

摘要

X染色体失活是哺乳动物维持雌雄性细胞中X染色体连锁基因剂量平衡的一种机制。它存在随机失活(父性和母性来源的X染色体等机率失活)和印记失活(父性来源的X染色体定向失活)两种方式，但是X染色体调控元件(Xce)等遗传和表观遗传因素会导致X染色体偏斜式失活，即X染色体偏向父性或母性一方失活。我们采用双荧光素酶报告基因检测系统和凝胶迁移实验比较了Musmusculus musculus(129)和Mus musculus castaneus strain(cast)小鼠品系的Tsixmajor promoter，Xite，DXPas34，Xist minimal promoter区域的活性，寻找出Xistminimal promoter是一个Xce，且-88位的A/C碱基差异是导致129和cast Xistminimal promoter活性差异的主要原因。
　　 另外，我们初步建立了DNA亲和纯化体系。我们用来源于Xist intron1的2b1-3 DNA探针纯化和质谱鉴定出PTB，但经凝胶迁移实验超迁移和染色体免疫共沉淀验证出PTB并不结合Xist2b1-3。因此我们还需要通过提高蛋白纯化效率、回收效率和胶分辨率等来优化DNA亲和纯化体系，寻找到特异DNA序列上的结合蛋白。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第一节 X染色体失活调控机制介绍

1.1.1 X染色体失活与胚胎发育

1.1.2 XCI调控过程

1.1.3 XCl分子调控机制

1.1.4 Xist和Tsix的调控机制

第二节 偏斜式X染色体失活调控机制的介绍

1.2.1 偏斜式X染色体失活与X染色体失活调控元件

1.2.2 影响偏斜式X染色体失活的其他因素

第三节 课题的提出及研究路线

1.3.1 Xce定位的相关研究

1.3.2 Xce的候选者

1.3.3 Xce定位的研究目的

1.3.4 Xce定位的研究模型

1.3.5 Xce定位的研究路线

第二章 材料与方法

第一节 实验材料与仪器

2.1.1 细胞及基因组DNA

2.1.2 化学药品

2.1.3 生化试剂

2.1.4 细胞培养药品及相关试剂

2.1.5 实验试剂盒

2.1.6 实验仪器

2.1.7 细胞培养耗材

第二节实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2129和cast相关区域序列获得及比对

2.2.3 凝胶迁移实验(EMSA)

2.2.4 双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Assay)

2.2.5 蛋白免疫杂交实验(Western blotting)

2.2.6 染色体免疫共沉淀(CHIP)

2.2.7 DNA亲和纯化

2.2.8 DNA亲和纯化的改进

2.2.9 点突变

第三章 实验结果

第一节 Xce的定位研究

3.1.1 Tsix promoter区域Xce的鉴定

3.1.2 Xite区域Xce的鉴定

3.1.3 DXPas34区域Xce的鉴定

3.1.4 Xist promoter区域Xce的鉴定

第二节 DNA亲和纯化方法的探索

3.2.1 DNA亲和纯化探针选择

3.2.2 DNA中偶联探针的配基选择和DNA探针的改进

3.2.3 DNA亲和纯化中竞争性探针浓度的摸索

3.2.4 DNA亲和纯化中KCl洗脱浓度的摸索

3.2.5 DNA亲和纯化体系确定

3.2.6 质谱分析结果

第三节 验证Xist 2b1-3针结合的目的蛋白是否为PTB

3.3.1 Western blot验证质谱结果

3.3.2 Super-shift EMSA验证PTB蛋白与Xist 2b1-3探针的结合

3.3.3 ChIP验证PTB是否与Xist 2b1-3的结合

第四节 DNA亲和纯化方法的改进

3.4.1 Hitrap Heparin柱洗脱液各组分EMSA分析

3.4.2 目的蛋白回收效率和纯化效率分析

3.4.3 DNA亲和纯化Hitrap Heparin柱纯化后的蛋白

第四章 讨论部分

第一节 Xce的定位研究部分讨论

第二节 DNA亲和纯化方法的探索部分讨论

参考文献

致谢

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