人类疱疹病毒8型ORF57片段的表达纯化及抗体制备

摘要

ORF57是人类疱疹病毒8型（human herpesvirus8，HHV-8）病毒裂解周期基因表达的一个多功能调节蛋白。HHV-8ORF57在细胞裂解感染时表达，并且它对病毒的复制是必须的。ORF57促进病毒无内含子RNA的富集和输出。尽管同家族的其它成员蛋白一般会抑制细胞内RNAs剪接，HHV-8ORF57和EBVEB2相反地会刺激病毒RNA剪接来促进病毒有内含子基因的表达。HHV-8ORF57的这些功能不依赖于其它的病毒蛋白，却依赖于蛋白-RNA复合体中会出现的一些细胞内因子。另外，ORF57可能与ORF50协同作用，特异性地反式激活一些病毒启动子。
　　 本文以pET28a为载体，根据蛋白亲疏水性预测设计结果和构建了HHV-8ORF57九个片段目的蛋白的原核表达质粒。ORF57九个目的片段蛋白的表达有较大差异，其中两个表达量极少（ORF5718-455 aa和18-369 aa），两个表达的大量蛋白以不溶性的包涵体形式出现（112-455 aa和112-369 aa），三个表达的蛋白出现了多条降解带（18-135 aa、18-159 aa和18-197aa），选择表达情况较好的两个（88-197 aa和112-197 aa）来大量表达目的蛋白并制备了相应的多克隆抗体anti-ORF57(88-197)和anti-ORF57(112-197)。在对两个目的蛋白作大量纯化的过程中发现，提高纯化过程中结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液中的NaCl浓度不仅能够提升目的蛋白纯化的纯度，并且还防止了过夜透析后目的蛋白聚集形成许多白色沉淀。所制备的anti-ORF57(88-197)抗体在抗原上样量50ng情况下，当稀释度达到1∶32000时表现出良好的特异性，当稀释度达到1∶64000时仍能检测到目的蛋白。anti-ORF57(112-197)抗体在抗原上样量15 ng情况下，当稀释度达到1∶8000时表现出良好的特异性，当稀释度达到1∶64000时仍能检测到目的蛋白。本文的工作为HHV-8ORF57的表达研究积累了实验材料。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 HHV-8简介

1．1．1 HHV-8基因组简介

1．1．2 HHV-8基因组的特点

1．1．3 HHV-8的生活周期

第二节 HHV-8 ORF57基因及其表达产物

1．2．1 HHV-8 ORF57的基因结构

1．2．2 HHV-8 ORF57表达动力学及其定位

1．2．3 HHV-8 ORF57二级结构

第三节 HHV-8 ORF57的功能

1．3．1 HHV-8 ORF57在转录后水平促进无内含子基因的表达

1．3．2 HHV-8 ORF57作为剪接因子调节病毒RNAs剪接

1．3．3 HHV-8 ORF57在病毒转录中的作用

1．3．4 HHV-8 ORF57其它可能的功能

1．3．5 问题和展望

第四节 本文的研究意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 引物

2．1．3 质粒

2．1．4 试剂

2．1．5 软件

第二节 实验方法

2．2．1 质粒的构建

2．2．2 目的重组蛋白的诱导表达与纯化

2．2．3 多克隆抗体的制备

2．2．4 蛋白免疫印迹系列检测

第三章 实验结果

第一节 质粒的构建

3．1．1 pET28a-ORF57(18-455)的构建

3．1．2 pET28a-ORF57(112-455)的构建

3．1．3 pET28a-ORF57(18-369)的构建

3．1．4 pET28a-ORF57(112-369)的构建

3．1．5 pET28a-ORF57(18-135)的构建

3．1．6 pET28a-ORF57(18-159)的构建

3．1．7 pET28a-ORF57(18-197)的构建

3．1．8 pET28a-ORF57(88-197)的构建

3．1．9 pET28a-ORF57(112-197)的构建

第二节 蛋白的表达和纯化

3．2．1 高量表达可溶性蛋白构建的筛选

3．2．2 ORF57(88-197)的表达和纯化

3．2．3 ORF57(112-197)的表达和纯化

第三节 抗体的制备及测试

3．3．1 anti-ORF57(88-197)抗体测试

3．3．2 anti-ORF57(112-197)抗体测试

第四章 讨论

第一节 外源表达片段的选择

第二节 目的蛋白的表达与纯化

4．2．1 目的蛋白在诱导表达中的表现

4．2．2 透析过程中蛋白的行为和洗脱缓冲液中的NaCl有关

第三节 抗体灵敏度和特异性评价

4．3．1 对anti-ORF57(88-197)抗体的评价

4．3．2 对anti-ORF57(112-197)抗体的评价

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历