球毛壳菌(Chaetomium globosum)的EMS诱变育种及NK-101生长条件的优化

摘要

球毛壳菌（Chaetomium globosum）分布广泛，具有分解纤维素的能力。球毛壳菌生长过程中可以产生丰富的次级代谢产物，其中一些代谢产物表现出一定的抗真菌活性，球毛壳菌还可以作为一种植物病害广谱生物防治真菌。球毛壳甲素是球毛壳菌的重要次级代谢产物，具有抗癌和抗植物致病性真菌的作用。球毛壳甲素能够有效抑制人类致病菌新型隠球酵母、白假丝酵母和植物致病菌终端腐霉的生长。此外，该种内的有些菌株还可致病，引起人类皮肤和指甲的暗色丝孢霉病。本实验室分离得到的一株球毛壳菌NK-102，能够产生球毛壳甲素。本实验室前期工作发现球毛壳甲素对根节线虫有很强的杀死作用，有可能开发成一种生物农药。
　　因此本实验利用EMS化学诱变NK-102，筛选高产球毛壳甲素的突变菌株。为了快速高效筛选高产球毛壳甲素的突变株，成功构建了双层平板抑菌圈法。指示菌为对球毛壳甲素敏感的酵母AD1-8tax工程菌株，7μM的球毛壳甲素就可对该菌株达到完全致死的效果。酵母AD1-8tax的最适工作浓度为106个/mL，该浓度下的抑菌效果显著，2d就可以看到有明显的抑菌圈出现，大大地缩短传统筛选突变株的工作量，同时也缩短了筛选周期。
　　复筛选用高效液相色谱技术检测突变株的发酵液，并发现高产球毛壳甲素的突变株。绘制球毛壳甲素标准回归曲线，对发酵产物中的球毛壳甲素进行精确定量，发现五株突变株的产量明显高于野生型的球毛壳甲素产量，其中突变子ru-65的球毛壳甲素是野生型的2.65倍。
　　本文还对NK-101的最适生长条件进行优化。本实验室分离得到一株拟盘多毛孢属真菌（Pestalotiopsis malicola），并鉴定其发酵产物含有紫杉醇，命名为NK-101。为使其生长达到最优并促使菌体到平台期之后可以产生更多的次级代谢产物，并且找到一种适合NK-101生长的培养基来提高发酵液的流动性，为工业化生产及后续提纯工作提供了便利。因此，本文进一步优化了产紫杉醇真菌NK-101的生长条件。首先，对各种培养基进行摸索，发现PDA培养基为NK-101的最适培养基。其次，对最佳碳源进行了摸索，发现以乳糖为碳源添加入PDA培养基后，能促进菌体进行次级代谢，并能够大幅度提高发酵液的流动性，为工业化生产及后续提纯工作提供了便利。随后测定了以乳糖PDA为培养基的NK-101生长曲线，发现菌体生长到第8天时，菌丝的生物量最大。
　　最后，对不同种类和浓度的氮源、微量元素、紫杉醇合成前体以及植物细胞培养过程中所添加的诱导物进行了单因素实验，最终发现苯丙氨酸5 mg/L、醋酸钠5 mg/L、乳糖20 g/L，大豆蛋白胨2g/L等对NK-101生物量合成具有促进作用。