miR-20b对Th17细胞分化和实验性自身免疫性脑脊髓炎发病的调控机制研究

摘要

Th17细胞作为第三类效应性CD4+T细胞，在多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)中发挥重要的致病作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种针对人类MS建立的被广泛应用的动物模型。EAE是由CD4+T细胞介导的中枢神经炎症，组织学表现为中枢神经脱髓鞘及炎症性Th1和Th2细胞浸润。miRNA是一类小的非转录RNA，通常通过转录后调控影响靶基因表达。目前，大量研究表明miRNAs在Th17细胞诱导的自身免疫疾病方面发挥重要作用，例如人类的MS。有研究显示miR-20b在MS临床病人的外周血细胞中低表达，但是miR-20b在Th17细胞分化及EAE中的调控作用未见报道。
　　我们首先建立了EAE，作为探讨miR-20b对于MS致病作用影响的动物模型。我们发现miR-20b在来自于EAE小鼠的CD4+T细胞中显著低表达。此外，通过将na(i)ve CD4+T细胞在体外以natural、Th1、Th2、Th17、Treg不同方向分化而检测其中miR-20b的表达，我们发现相对于natural CD4+T细胞，miR-20b在Th17细胞中显著低表达，而在Th1、Th2和iTreg细胞中则变现为表达上升。基于上述结果，我们推测miR-20b可能通过影响Th17分化而在EAE的发病过程中参与调控。因为miRNAs主要通过其靶基因发挥调控作用，因此我们继续寻找与Th17细胞分化相关的miR-20b可能的靶基因。
　　我们利用小鼠TargetScan数据库来预测miR-20b的备选靶基因。通过荧光素酶检测、GFP抑制实验和免疫印迹实验，我们鉴定并确定RORγt和STAT3为miR-20b可能的靶基因。我们还发现miR-20b分别在mRNA水平抑制STAT3基因表达，在转录后水平抑制RORγt基因表达两种不同机制发挥其调控作用。
　　考虑到RORγt和STAT3作为Th17细胞分化的主要调控基因，我们推测miR-20b可能直接参与Th17细胞分化的调控。在Th17细胞体外分化过程中，通过分别转染miR-20b的阴性对照(NC)、抑制序列(inhibitor)及模拟序列(mimics)，我们发现mimics转染组IL-17A表达显著下调，而inhibitor转染组IL-17A表达轻微上调。相同的，三组IL-17F表达与IL-17A表达类似。与此一致，我们发现在三组转染细胞的培养上清中，IL-17A和IL-17F的表达也可以被miR-20b的mimics显著下调。我们进一步将miR-20b NC、inhibitor及mimics用FAM荧光标记，以检测转染阳性细胞中Th17细胞相关IL-17A和IL-17F的表达，结果与上面类似。上述结果证明miR-20b可以在体外负向调控Th17细胞的分化。
　　为了进一步验证我们的预测，即miR-20b可能在体内调控EAE的发病进程，我们构建了pri-miR-20b慢病毒表达载体。小鼠尾静脉分别注射表达pri-miR-20b(LV-miR-20b)及阴性对照(LV-NC)的慢病毒，7天后，诱导EAE发病，结果显示LV-miR-20b感染组小鼠发病分值统计显著减轻。腰髓切片组织学分析显示LV-miR-20b感染组的小鼠炎症浸润及脱髓鞘情况也显著缓解。此外，小鼠免疫后14天尾静脉注射上面两种慢病毒，结果显示LV-miR-20b感染组的小鼠疾病严重程度亦有所下降，这些结果提示miR-20b能够抑制EAE的发病进程。
　　为继续深入探讨miR-20b是否能够在EAE发病过程中对于Th17细胞的产生有所影响。我们收集LV-miR-20b及LV-NC感染小鼠中枢神经系统的单核细胞进行分析，结果显示在LV-miR-20b感染组小鼠的中枢神经系统中CD4+T细胞浸润显著减少，进一步胞内细胞因子分析结果显示Th17细胞比例也显著降低。在LV-miR-20b感染组小鼠的引流淋巴结中，我们也发现更少的Th17细胞浸润，此外，将这些淋巴细胞体外培养并用诱导EAE发病的MOG35-55再刺激,LV-miR-20b感染组的细胞培养上清中IL-17A的表达也相应减少。上述结果表明miR-20b在EAE发病过程中可以在体内抑制Th17细胞的产生。
　　最后，我们发现EAE发病小鼠脾脏中CD4+T细胞的RORγt和STAT3蛋白表达较正常小鼠显著上升。此外，在都诱导小鼠EAE发病的前体下，相对于LV-NC感染组，LV-miR-20b感染组小鼠脾脏中CD4+T细胞的RORγt和STAT3蛋白表达显著被下调。我们进一步证明miR-20b在体内可能通过靶向调控RORγt和STAT3表达来抑制EAE的病程发展及Th17细胞产生。
　　总之，我们的结果展示了miR-20b在Th17细胞分化以及EAE发病过程中的重要调控作用，基于此，miR-20b很可能成为人类多发性硬化症的诊断生物标记或是治疗靶点。