选择性PPARγ调节剂治疗Ⅱ型糖尿病的药物筛选与药效学评价

摘要

目前，糖尿病已经成为了继心脑血管疾病和癌症之后严重威胁人类健康的第三大疾病。其中糖尿病患者中约95％为Ⅱ型糖尿病患者。Ⅱ型糖尿病主要的发病基础是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗的概念是指机体对一定浓度的胰岛素的生物学作用不能保持正常水平，表现为胰岛素的靶器官或靶组织对胰岛素敏感性及反应性降低。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核受体家族成员，是配体激活转录因子，参与葡萄糖和脂代谢的调节，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗。
　　噻唑烷二酮类是一种针对PPARγ的糖尿病治疗药物，其不良反应有增加体重，水肿和水潴留，诱发和加重心功能不全及肺水肿。因此，具有胰岛素增敏效果而无其他副作用的选择性PPARγ部分激动剂是开发新型Ⅱ型糖尿病药物的方向。
　　本研究建立了基于萤火虫荧光素酶报告基因的新药筛选模型。通过将PPARγ的配体结合区（PPARγ-LBD）基因序列克隆到含有GAL4 DNA结合域的pBIND载体构建pBIND-PPARγ-LBD的重组质粒。该质粒与含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pG5 luc质粒共转染至HEK-293T细胞中，通过测定萤火虫荧光素酶的活性评价化合物的转录激活活性。之后对MDC小分子片段库进行化合物筛选。而且对PPARγ-LBD蛋白进行表达纯化，在质谱水平上验证筛选出的化合物与PPARγ-LBD蛋白是否有结合活性。
　　利用糖皮质激素-地塞米松刺激HepG2细胞使之产生胰岛素抵抗，从而建立胰岛素抵抗模型。在此细胞模型上进行体外药效学筛选。为了进一步明确化合物的降糖作用，利用高脂饮食联合链脲佐菌素建立Wistar大鼠Ⅱ型糖尿病模型，对化合物进行体内水平药效筛选。实验结果证明，化合物MDCCCL1636能够在细胞水平改善胰岛素抵抗;改善糖尿病大鼠体重;明显降低血清中的葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的浓度，升高高密度脂蛋白的水平;降低给糖后的高血糖作用。结果表明化合物MDCCCL1636能够改善糖脂代谢紊乱，对Ⅱ型糖尿病有较好的治疗作用。
　　通过体外细胞毒性实验、斑马鱼胚胎发育毒性实验和大鼠急性毒性实验，对化合物MDCCCL1636进行体内外毒性评价，结果表明MDCCCL1636的毒性小于匹格列酮。
　　最后，对化合物影响细胞内的信号传导通路进行研究，化合物MDCCCL1636能够提高AKT、GSK-3β、GS的活性，表明化合物通过PI3K信号途径调节糖脂代谢。
　　总之，本研究通过体内体外多种筛选方法筛选，筛选出化合物MDCCCL1636具有PPARγ部分激动活性，能够改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，且具有新结构低毒性的特点。此化合物有希望成为Ⅱ型糖尿病的新的预防和治疗药物。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 糖尿病简介

1．1．1 Ⅰ型糖尿病

1．1．2 Ⅱ型糖尿病

第二节 胰岛素抵抗与Ⅱ型糖尿病

1．2．1 胰岛素抵抗(IR)发生机制

1．2．2 胰岛素抵抗(IR)导致Ⅱ型糖尿病的机理

第三节 治疗Ⅱ型糖尿病药物的研究现状

1．3．1 促进胰岛素分泌类

1．3．2 葡萄糖代谢改善剂

1．3．3 胰岛素增敏剂

1．3．4 α-葡萄糖苷酶抑制剂

1．3．5 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物

1．3．6 二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂

第四节 PPARγ研究现状

1．4．1 PPARγ的结构与功能

1．4．2 PPARγ的配体

1．4．3 PPARγ与胰岛素抵抗

第五节 实验方案设计

1．5．1 研究目的及意义

1．5．2 主要研究内容

第二章 分子水平药物筛选

第一节 萤火虫荧光素酶报告基因筛选模型建立及药物筛选

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 实验结果

第二节 PPARγ配体结合区的表达纯化及与化合物相互作用质谱鉴定

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 实验结果

第三章 药效学评价

第一节 胰岛素抵抗细胞模型的建立及药物筛选

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 实验结果

第二节 基于Ⅱ型糖尿病大鼠模型的药效学检测

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果

3．2．4 小结

第四章 化合物毒性实验

第一节 体外毒性实验

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．1．3 实验结果

第二节 斑马鱼发育毒性实验

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．2．3 实验结果

第三节 大鼠急性毒性试验

4．3．1 实验材料

4．3．2 实验方法

4．3．3 实验结果

第五章 化合物的初步研究

第一节 实验材料

5．1．1 细胞

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验仪器

5．1．4 缓冲液配制

第二节 实验方法

5．2．1 制备细胞样品

5．2．2 SDS-PAGE

5．2．3 Western Blot

第三节 实验结果

5．3．1 MDCCCL1636和匹格列酮对胰岛素抵抗细胞AKT磷酸化的影响

5．3．2 MDCCCL1636和匹格列酮对胰岛素抵抗细胞GSK-3β磷酸化的影响

5．3．3 MDCCCL1636和匹格列酮对胰岛素抵抗细胞GS磷酸化的影响

5．3．4 总结

第六章 结论

参考文献

致谢

个人简历