管状内质网的分离与蛋白组分析

摘要

管状内质网和片状内质网在细胞内呈现不同的形状和功能，而这些特征与它们所包含的蛋白质是紧密相关的，包括蛋白质的种类、数量。虽然已经有些报道研究了少数蛋白在管状和片状内质网形状维持，功能发挥中的重要作用，但是，到目前为止，还没有一个系统的实验数据来全面分析它们所含蛋白质的种类和数量的差异。本文我们用酿酒酵母作为实验材料，通过用管状和片状内质网上所特有的、已知的蛋白作为靶蛋白，用免疫沉淀(immunoprecipitation)的方法来分离纯化这两种组分所形成的微粒体(microsome)，然后通过丙酮沉淀来提取它们的蛋白组分，并结合定量质谱来鉴定它们的蛋白质组(proteome)，分析它们所含蛋白的种类和相对含量。进而为全面系统的分析，研究它们的功能奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 内质网

1．1．1 内质网的形态和功能

1．1．2 内质网形态的维持

1．1．3 微粒体

第二节 电子显微镜

1．2．1 组成

1．2．2 种类

第三节 细胞组分的分析方法

1．3．1 超速离心技术

1．3．2 层析法

1．3．3 其他方法

第四节 质谱

第二章 材料和方法

第一节 分子克隆

2．1．1 引物

2．1．2 模版与质粒

第二节 试剂和仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

第三节 配方

2．3．1 PCR反应体系

2．3．2 酶连接体系

2．3．3 Western相关buffer

2．3．4 SDS-PAGE胶的配方

2．3．5 酵母脂质体制备buffer

2．3．6 LiAC／TE buffer

2．3．7 微粒体制备buffer

第四节 实验方法

2．4．1 载体的构建

2．4．2 酵母转化

2．4．3 酵母中目的蛋白的表达验证

2．4．4 SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质印迹

2．4．5 酵母原生质体的制备

2．4．6 酵母细胞微粒体的制备与检验

2．4．7 微粒体的稳定性检验

2．4．8 微粒体蛋白的提取与纯化

2．4．9 免疫沉淀(Immunoprecipitation)

2．4．10 酵母细胞器的荧光观察

第三章 结果分析

第一节 实验的原理和流程

3．1．1 实验设计的基本原理

3．1．2 实验的流程

第二节 标签蛋白的选择与表达鉴定

3．2．1 标签蛋白的选择与表达验证

3．2．2 外源转入质粒对内质网形态的影响

第三节 酵母微粒体的制备

3．3．1 酵母细胞原生质体的制备

3．3．2 酵母细胞微粒体的制备

第四节 微粒体稳定性检验

3．4．1 冻融对微粒体的影响

3．4．2 水洗对微粒体完整性的影响

第五节 微粒体蛋白的提取纯化

第六节 微粒体的免疫沉淀

3．6．1 Nacl对免疫沉淀的影响

3．6．2 样品P100K的免疫沉淀

第七节 片状内质网标签蛋白的引入

第四章 讨论

参考文献

致谢

个人简历