藏药二十五味珊瑚丸化学成分分析及神经保护作用物质基础研究

摘要

二十五味珊瑚丸是经典的藏药验方，属于藏医珍宝类药品，收载于藏医经典著作《四部医典》中，在公元18世纪由藏医学创使人宇拓·元丹贡布创制，目前被《中国药典》（2010版）收载。它具有清热定惊、开窍通络、止痛等功效，用于治疗“白脉病”，即中枢神经系统疾病，如头疼、癫痫等。该方虽然已有上千年的使用历史，但是，至目前为止，其生物活性物质、体内代谢物及活性作用机理等仍不明确。二十五味珊瑚丸药效科学依据的缺乏，阻碍了其在临床上的运用和进一步发展;另外，2010版药典中对二十五味珊瑚丸只有简单的化学反应和西红花、红花主要成分的薄层色谱鉴别以及乌头碱的限量测定，涉及的药材少，代表性不足，缺乏组方药材的质控指标及定量标准，难以保证产品质量的稳定和用药的安全有效，因此，其质量标准有待完善和提高。
　　本研究采用UPLC-DAD/Q-TOF-MS、HPLC-ELSD、ICP-MS、GC-MS等多种联用技术，对二十五味珊瑚丸全方进行了系统的成分分析。采用UPLC-DAD/Q-TOF-MS建立了全方的液相指纹图谱，从中鉴定出6大类61个成分，归属于11味植物药材;用HPLC柱前衍生化法对全方中氨基酸类成分进行了分析，测定了15种氨基酸，其主要来自葫芦药材;用ICP-MS分析了全方中结合态、游离态和固态矿物元素，共测定了22种元素，其中常量元素4种，微量元素18种，主要来自10味矿物药材;用HPLC-ELSD分析全方游离糖和水解总糖的含量，测定了果糖和葡萄糖的含量;用GC-MS鉴定了全方中挥发性成分，共鉴定了3大类18个挥发性成分，归属于5味药材。在全方组方药材的研究方面，对于方中重要药材藏菖蒲及其易混淆药材石菖蒲，采用近红外技术对两者进行了区分，并测定了药材中主要成分的含量;用液质联用技术比较了草乌和铁棒锤的指纹图谱，同时比较分析了草乌与甘草、诃子配伍前后指纹图谱中双酯型乌头碱含量的变化，为全方用草乌替代铁棒锤的合理性及全方用甘草、诃子同时与草乌配伍的合理性提供了实验依据。在全方物质基础研究中，同时采用体外和体内研究方法通过OGD-R诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型对全方药效物质进行了筛选;在体外研究中，通过提取和分析，得到二十五味珊瑚丸不同提取层的主要物质信息，然后结合各提取层在不同浓度下的活性测定结果，用人工神经网络对提取层中潜在的药效物质进行了虚拟筛选;在体内研究中，采用血清药物化学的方法，用UPLC-DAD/Q-TOF-MS从灌胃后大鼠的血样、心、肝、肾和脑组织中共检测了36个主要外源性成分，包括20个原型药物和16个代谢物。结合体外虚拟筛选的结果和体内入血成分的测定结果，初步确定了主要的药效成分，并进行了单体活性验证;同时结合分子反向对接技术，对主要药效成分可能的靶点及相关通路进行了预测。
　　通过本研究，基本讲清了二十五味珊瑚丸的化学组成，采用不同的分析方法对全方中主要成分的含量测定，特别是对各药材特征成分的含量测定，有助于二十五味珊瑚丸质量标准的完善和提高。从全方的体外虚拟活性筛选和体内入血成分检测两个方面，确定了二十五味珊瑚丸的主要药效成分，为今后在分子水平上进一步研究其作用机理提供了重要的物质信息，同时为二十五味珊瑚丸产品的二次开发奠定基础。最终使之成为物质组成清楚，作用机理明确，安全、稳定、有效的现代化制剂。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一章 引言

第一节 二十五味珊瑚丸概况

1．1．1 组成、制法及配伍

1．1．2 临床用途及现代药理研究进展

1．1．3 化学成分研究进展

第二节 二十五昧珊瑚丸各单味药的化学成分及药理活性研究进展

1．2．1 植物药类

1．2．2 矿物药类

第三节 基于细胞模型的神经保护作用研究概况

1．3．1 常用的神经细胞种类

1．3．2 常用的神经细胞模型

1．3．3 中药神经保护作用成分及相关机理的研究现状

第四节 血清药物化学简介

第五节 近红外技术在中药分类及成分分析中的应用概况

第六节 研究目的和意义

第二章 二十五味珊瑚丸复方化学成分研究

第一节 全方液相指纹图谱研究

2．1．1 仪器、材料和试剂

2．1．2 实验方法

2．1．3 实验结果和讨论

第二节 不同提取层中有机小分子和无机矿物元素分析

2．2．1 仪器、材料和试剂

2．2．2 样品的制备与分析方法

2．2．3 测定结果与讨论

第三节 氨基酸类成分分析

2．3．1 仪器、试剂与材料

2．3．2 试验方法

2．3．3 结果与讨论

第四节 糖类成分分析

2．4．1 仪器、材料与试剂

2．4．2 供试品制备及分析方法

2．4．3 糖类成分含量测定结果

第五节 挥发油类成分分析

2．5．1 仪器、材料与试剂

2．5．2 样品的制备和分析方法

2．5．3 挥发油类成分分析结果

第六节 本章小结

第三章 二十五味珊瑚丸相关植物药的分析

第一节 基于近红外技术区分藏莒蒲和石菖蒲药材并测定主要成分的含量

3．1．1 仪器、材料和试剂

3．1．2 样品的制备与分析

3．1．3 藏菖蒲和石菖蒲判别模型的建立

3．1．4 β-细辛醚和α-细辛醚定量校正模型的建立

3．1．5 小结

第二节 基于液质联用技术研究草乌替换铁棒锤及草乌与其他组方药材配伍的合理性

3．2．1 草乌替代铁棒锤合理性的研究

3．2．2 草乌与甘草、诃子配伍合理性的研究

第三节 本章小结

第四章 二十五味珊瑚丸体内化学成分研究

第一节 二十五味珊瑚丸灌胃提取物和给药后大鼠生物样品的制备

4．1．1 二十五味珊瑚丸灌胃提取物的制备与分析

4．1．2 给药后大鼠生物样品的制备

第二节 二十五味珊瑚丸入血及组织成分的分析

4．2．1 仪器、材料和试剂

4．2．2 入血及组织成分的分析方法

4．2．3 入血及组织成分的分析结果

第三节 二十五味珊瑚丸体内代谢物的鉴定与分析

4．3．1 仪器、材料和试剂

4．3．2 体内代谢物的分析方法

4．3．3 体内代谢物的鉴定与分析结果

第四节 本章小结

第五章 二十五味珊瑚丸神经细胞保护作用研究

第一节 仪器、材料和试剂

5．1．1 仪器

5．1．2 材料

5．1．3 试剂

第二节 研究方法

5．2．1 细胞的复苏、培养和传代

5．2．2 样品制备

5．2．3 OGD-R(氧糖剥离再灌注)神经细胞损伤模型

5．2．4 MTS法测定细胞活力

5．2．5 双荧光素酶报告基因测定NF-κΒ浓度

第三节 结果和讨论

5．3．1 OGD-R诱导的神经细胞受损模型的建立

5．3．2 二十五味珊瑚丸不同提取液活性测定结果

5．3．3 基于人工神经网络模型对全方不同提取物进行虚拟活性筛选

5．3．4 主要药效成分的活性测定

5．3．5 基于分子反向对接技术预测主要药效成分的靶点及相关信号通路

5．3．6 二十五味珊瑚丸对脑缺血再灌注损伤治疗机制的探讨

第四节 本章小结

第六章 总结与展望

第一节 总结

第二节 展望

参考文献

附录

致谢

个人简历