转录因子FOXA1对黑色素瘤相关基因表达水平的调节

摘要

恶性黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)是一种由异常黑素细胞过度增生而引发的恶性程度极高的肿瘤，早期即可发生转移，且预后多数较差。目前对于黑色素瘤还没有一种行之有效的治疗方法，因此这也成为医学和生物学界的难点、热点问题。黑色素瘤的恶性程度主要表现在其早期即可发生远端转移，因此研究肿瘤的转移特性及相关机制对于预防及治疗黑色素瘤具有极为重要的意义。
　　上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions，EMT)是指具有极性的上皮细胞在特定生理或病理的条件下转化为无极性的间质细胞并获得游走及迁移能力的现象。是肿瘤转移的理论依据。恶性黑色素瘤虽然不是上皮来源的肿瘤，其在转移过程中也发生与EMT非常相似的“类EMT”现象。
　　在细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)中含有的多种可以诱导EMT的发生的细胞因子，其中包括CCN家族蛋白。目前研究证明，CCN蛋白不仅是胚胎发育所必需的调节因子，并且在炎症、创伤修复、纤维性疾病和肿瘤中有重要作用。该家族中研究最多的成员之一是结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor，CTGF/CCN2)。目前转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)已经被证实可以通过多种信号通路诱导CTGF的表达。本研究旨在寻找新的可以诱导CTGF表达的细胞因子。
　　实验室前期进行了对黑色素痣、黑色素瘤细胞系A375、A2058三种细胞进行高通量转录组测序工作，结合数据的挖掘及实验的验证，发现了关键因子(keyfacter)——FOXA1。在UCSC中索出CTGF的预测结合位点包括FOXA1转录因子。
　　FOXA1转录因子是Fox家族成员，在乳腺、肺、胰腺、肝脏、膀胱、前列腺、结肠等主要器官中均有表达，与许多肿瘤的发病机制、侵袭、转移及耐药性都密切相关。但是目前对于OXA1基因与黑色素瘤相关性的研究几乎是空白，这也是本研究的原创性所在。
　　实验结论:本课题通过双荧光素酶报告基因检测实验和Real-time PCR实验预测转录因子FOXA1通过调控CTGF的表达，进而调节肿瘤增值、侵袭、粘附等与EMT相关的促肿瘤因子的表达水平。

目录

声明

摘要

专业词汇中英文对照表

第一章 绪论

第一节 黑色素瘤

第二节 EMT简介

第三节 CCN简介

1．3．1 CCN家族简介

1．3．2 CCN家族的发现、结构与命名

1．3．3 CCN蛋白的功能

第四节 CTGF简介

1．4．1 CTGF蛋白简介

1．4．2 CTGF基因定位与蛋白结构

1．4．3 CTGF蛋白的功能

1．4．4 CTGF蛋白与肿瘤

第五节 Fox家族简介

1．5．1 Fox家族的发现与命名

1．5．2 人类FOX基因的定位

1．5．3 Fox蛋白的结构

1．5．4 Fox蛋白DNA的识别机制

1．5．5 Fox蛋白的功能

1．5．6 FoxA

1．5．7 FOXA1

第六节 双荧光素酶报告基因技术原理

第七节 ChIP-seq技术原理

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

2．1．1 引物

2．1．2 质粒

2．1．3 感受态细胞

2．1．4 细胞样品

2．1．5 实验试剂和耗材

2．1．6 试剂盒

2．1．7 培养基和培养液

2．1．8 实验仪器

2．1．9 DNA测序

2．1．10 引物合成

2．1．11 生物信息学分析网站、软件

第二节 实验步骤及方法

2．2．1 设计引物

2．2．2 PCR产物的制备

2．2．3 质粒的制备

2．2．4 双酶切产物的制备

2．2．5 PCR产物与质粒的连接及转化

2．2．6 质粒的鉴定、提取

2．2．7 质粒的转染及荧光素酶报告基因检测

2．2．8 Real-time PCR

第三章 结果与讨论

第一节 分子克隆

3．1．1 CTGF启动子序列的选择

3．1．2 PCR实验

3．1．3 双酶切产物的纯化

3．1．4 质粒的鉴定

3．1．5 测序结果

第二节 双荧光素酶报告基因检测

第三节 Real-time PCR

3．3．1 FOXA1基因在细胞中的过表达情况

3．3．2 过表达FOXA1对内源性CTGF基因的活化作用

3．3．3 过表达FOXA1对细胞内其他主要的肿瘤调控因子的影响

3．3．4 FOXA1过表达后影响的下游通路

第四章 结论

第五章 展望

参考文献

致谢

个人简历