基于抗炎生物活性导向的不同品系菊花质量标准研究

摘要

菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。许多研究表明，菊花有着多方面的生物活性，例如，抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌和心血管的保护作用。根据生长地区和加工过程的不同，菊花可以分为亳菊（安徽亳州）、滁菊（安徽滁州）、贡菊（安徽黄山）、杭白菊（浙江桐乡）和怀菊（河南焦作）五个主要品种。实际上，这五种菊花在药用和茶饮中都没有很明显的区分，他们在药典里都被归为“菊花”。当前，只有绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A被药典规定为含量检测的成分，至今仍没有关于与生物活性关联的区分几个菊花品种的全面报道。而这会对菊花的质量和安全性产生严重的影响。更严重的是，现在中药材市场上菊花的质量差异很大，仍然存在着大量的不合格产品。所以，很有必要建立一个能快速有效的检测菊花质量的方法体系。
　　在本实验中，我们首先在体内和体外对菊花的抗炎效果进行了评价。建立了铜绿假单胞菌感染的小鼠肺部急性感染模型，结果表明，菊花给药后能显著提高小鼠的存活率，降低TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子的表达，减少肺部细胞因子及免疫细胞的浸润，改善肺部组织的水肿、坏死脱落。另外，建立了肿瘤坏死因子-α刺激人肾上皮细胞产生的炎症模型，利用双荧光素酶报告基因系统对50批菊花给药后NF-κB的表达进行检测，结果发现，在亳菊、滁菊、贡菊、杭白菊和怀菊中分别有5，4，6，7，6个批次有抗炎活性，说明市场上售卖的菊花样品并不是都有着很好的生物活性，其质量参差不齐。
　　对50批菊花样品进行了UPLC-Q/TOF MS分析，然后利用主成分分析和偏最小二乘法分析，对50批样品的质谱数据进行分析，由得分图可知，5种菊花样品有着很明显的分离趋势，分离度较大，从载荷图中分析得到了19个对分类贡献最大的标记物。
　　实验采用了热图分析的方法对19个标记物在50个菊花样品中的相对含量进行了分析。另外，利用人工神经网络（ANN）分析方法，对19个标记物和50个样品的生物活性间的关系进行了分析。分析热图结果，发现19个标记物在50个样品中的含量分布没有明显的规律性，而通过ANN分析后，得到6个含量与生物活性成正相关的单体，分别为绿原酸、芹菜素-7-O-新陈皮糖苷、异绿原酸A、雏菊叶龙胆酮、木犀草素、芹菜素-7-O-半乳糖苷和去甲当药苷，其中绿原酸和木犀草素的含量变化与生物活性变化成完全的正相关关系。因此，这两个单体是我们后续研究的重点对象。
　　实验建立了一种简便、快速的UPLC/Q-TOF-MS结合双荧光素酶报告基因系统的筛选NF-κB抑制剂的分析方法，对菊花样品中的抗炎成分进行筛选鉴定，共筛选出3种结构类型的NF-κB抑制剂，分别为:咖啡酰基奎宁酸类（绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B），黄酮类（木犀草素、木犀草素-7-O-芸香糖苷，木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-6

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 中药质量控制研究

1．1．1 中药现状概述

1．1．2 中药质量控制技术

第二节 几种常见化学计量学在中药质量控制中的应用

1．2．1 化学计量学简介

1．2．2 主成分分析法

1．2．3 系统聚类分析法

1．2．4 偏最小二乘法

1．2．5 人工神经网络法

第三节 菊花研究进展

1．3．1 菊花品种分类

1．3．2 菊花化学物质组学研究

1．3．3 菊花药理作用研究

第四节 论文立题意义

第二章 菊花体内外抗炎药效研究

第一节 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验动物

2．1．4 实验菌株

第二节 实验方法

2．2．1 菊花样品准备

2．2．2 动物实验分组及给药

2．2．3 小鼠肺部急性感染模型的建立

2．2．4 血浆炎症因子测定

2．2．5 肺组织HE染色

2．2．6 细胞培养方法

2．2．7 双荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染

2．2．8 细胞实验分组及给药

2．2．9 NF-κB荧光素酶活性检测

2．2．10 统计分析方法

第三节 实验结果

2．3．1 实验小鼠存活率图

2．3．2 实验小鼠血浆中炎症因子的表达

2．3．3 实验小鼠肺部病理切片结果

2．3．4 五种菊花药材外观形态观察

2．3．5 五种50批不同品系菊花对NF-κB表达的影响

第四节 小结与讨论

第三章 不同品系菊花的UPLC／Q-TOF及聚类分析

第一节 实验试剂与仪器

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

第二节实验方法

3．2．1 菊花样品制备

3．2．2 UPLC色谱条件

3．2．3 Q-TOF实验条件

3．2．4 实验方法学考察

3．2．5 PCA及PLS-DA分析

3．2．6 标记物的结构鉴定

第三节 实验结果

3．3．1 实验方法学考察结果

3．3．2 五种菊花样品PCA及PLS-DA结果

3．3．3 标记物结构鉴定结果

第四节 小结与讨论

第四章 菊花样品热图及人工神经网络分析

第一节 实验材料

4．1．1 实验软件

第二节 实验方法

4．2．1 菊花样品热图分析方法

4．2．2 菊花样品神经网络分析方法

第三节 实验结果

4．3．1 菊花样品热图分析结果

4．3．2 菊花样品神经网络分析结果

第四节 实验讨论

第五章 菊花抗炎活性物质筛选

第一节 实验试剂与仪器

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

第二节 实验方法

5．2．1 菊花样品制备

5．2．2 UPLC色谱条件

5．2．3 Q-TOF实验条件

5．2．4 UPLC分段样品的制备

5．2．5 细胞培养方法

5．2．6 双荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染

5．2．7 细胞实验分组及给药

5．2．8 NF-κB荧光素酶活性检测

5．2．9 活性物质结构鉴定方法

5．2．10 统计分析方法

第三节 实验结果

5．3．1 菊花分段样品对NFκB表达的影响

5．3．2 菊花抗炎活性物质结构鉴定结果

第四节 小结与讨论

第六章 菊花样品HPLC定量分析

第一节 实验试剂与仪器

6．1．1 主要试剂

6．1．2 主要仪器

第二节 实验方法

6．2．1 菊花样品溶液的制备

6．2．2 对照品溶液的制备

6．2．3 HPLC色谱条件

6．2．4 实验方法学考察

6．2．5 PLS-DA分析

第三节 实验结果

6．3．1 实验方法学考察结果

6．3．2 定量分析结果

6．3．3 PLS-DA分析结果

第四节 小结与讨论

第七章 总结与展望

第一节 总结

7．1．1 体内外药效学评价

7．1．2 UPLC／Q-TOF及PCA、PLS-DA分析

7．1．3 热图及ANN分析

7．1．4 抗炎有效成分的快速筛选

7．1．5 HPLC定量分析

第二节 展望

7．2．1 方法的应用

7．2．2 有效成分的全面筛选

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表论文