聚氨基酸的微生物合成及其分子生物学研究

摘要

聚氨基酸具有水溶性、生物可降解性以及生物相容性等，在食品、医药和工业领域具有广阔的应用前景。
　　本研究对γ-聚谷氨酸合成菌株Bacillus amyloliquefaciens LL3进行全基因组测序，对基因组序列进行生物信息学分析。研究了Bacillus amyloliquefaciens LL3基因组的IS序列、噬菌体相关序列和跨膜蛋白等，对Bacillus amyloliquefaciensLL3细胞内的L/D谷氨酸代谢通路进行分析，对γ-聚谷氨酸相关的生物合成和代谢调控基因进行了研究。为深入开展γ-聚谷氨酸的分子生物学研究奠定了基础。
　　本研究分别从福建古田和辽宁沈阳农田土壤中，利用添加亚甲基蓝的甘油合成平板初筛，以Dragendorff试剂复筛，分离得到两株ε-聚赖氨酸合成菌株。根据16S rDNA序列特征，确定均为链霉菌属;根据伯杰氏手册第八版中的链霉菌属检索表，进行了培养特征和碳源利用试验。结果显示出两菌株均为小白色链霉菌（Streptomyces albulus）。被分别命名为Streptomyces albulus NK660和Streptomyces albulus NK49。
　　本研究利用正交设计方法，对Streptomyces albulus NK660发酵生产ε-聚赖氨酸的培养基进行了优化。单因素试验结果表明，最佳碳源和氮源分别是甘油、蛋白胨和硫酸铵。正交试验极差分析显示，甘油是影响最为显著的因素，Streptomyces albulus NK660合成ε-聚赖氨酸的培养基的最佳组合为:甘油30g/L，蛋白胨7g/L，硫酸铵4g/L。方差分析显示，得到的结果在99％的置信区间内影响显著。30 L规模的控制pH条件下补料分批发酵试验表明，Streptomycesalbulus NK660在培养210h后得到ε-聚赖氨酸产量为4.19 g/L。
　　对发酵液中产物提取方法进行了探索，研究弱酸型离子交换树脂D152对ε-聚赖氨酸的吸附曲线，最大吸附量以及发酵液pH对吸附的影响。利用核磁共振，飞行时间质谱，傅里叶红外光谱分析，对两株ε-聚赖氨酸合成菌株的产物进行了鉴定和分析。结果表明，产物的核磁共振图谱与标准品一致;飞行时间质谱的结果表明，Streptomyces albulus NK660产物分子量为2453-4248，聚合度为19-33; Streptomyces albulus NK49产物分子量为2710-4376，对应聚合度为22-34。由于ε-聚赖氨酸的抗菌机理与聚合度紧密相关，所以不同聚合度的ε-聚赖氨酸具有不同抗菌谱，在不同的领域具有应用价值。
　　另外，本研究利用分子生物学手段，对ε-聚赖氨酸合成菌株Streptomycesalbulus NK660的合成酶进行了研究。采用染色体步移技术，在Streptomycesalbulus NK660中克隆到了ε-聚赖氨酸合成酶全基因。利用链霉菌中的高拷贝克隆载体pHZ1358，在ε-聚赖氨酸合成酶基因自身启动子的控制下，首次在Streptomyces lividans ZX7中实现了ε-聚赖氨酸合成酶基因的异源表达。异源表达对于研究ε-聚赖氨酸生物合成的分子机制和合成菌株培养条件的简化都具有重要意义。
　　在发酵过程中溶氧是ε-聚赖氨酸合成的主要限制因素。本研究首次在ε-聚赖氨酸合成菌株中表达了透明颤菌血红蛋白VHb，以解决在发酵过程中的溶氧限制问题。利用位点特异性整合载体pSET152，将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到Streptomyces albulus NK660染色体的attB位点，构建了稳定的工程菌株Streptomyces albulus NK660-VHb。利用CO差光谱法，检测到工程菌株中血红蛋白的表达量明显。摇瓶发酵实验表明，由于Streptomyces albulus NK660-VHb溶氧利用率的提高，其生长速度明显加快、菌体量增多，ε-聚赖氨酸产量比野生菌株提高了27％。

目录

声明

摘要

论文缩略词一览表

第一章 前言

第一节 自然界中的聚氨基酸及其微生物合成

1．1．1 γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸

1．1．2 聚氨基酸的生物合成

第二节 γ-PGA的微生物合成

1．2．1 γ-PGA合成菌株

1．2．2 γ-PGA的生物合成机制

1．2．3 γ-PGA合成菌株的基因组学研究进展

第三节 ε-PL及其微生物合成相关研究

1．3．1 ε-PL合成菌株

1．3．2 ε-PL的生物合成代谢调控和发酵特征

1．3．3 ε-PL合成菌株的降解作用

1．3．4 ε-PL合成机制

1．3．5 ε-PL的生物学活性与应用

第四节 透明颤菌血红蛋白及其在微生物代谢工程中的应用

1．4．1 VHb的作用机制

1．4．2 VHb在微生物代谢工程中的应用

第五节 本课题的主要内容与研究意义

第二章 γ-PGA合成菌株LL3的基因组学研究

第一节 引言

第二节 实验材料和方法

2．2．1 实验菌株

2．2．2 基因组DNA的提取

2．2．3 测序与数据拼接

2．2．4 基因组序列的预测与注释

2．2．5 基因组序列的分析

第三节 实验结果与讨论

2．3．1 B．amyloliquefaciens LL3基因组DNA的提取

2．3．2 B．amylotiquefaciens LL3基因组序列及遗传特点

2．3．3 B．amyloliquefaciens LL3基因组编码氨基酸及密码子使用特点

2．3．4 B．amyloliquefaciens LL3基因组中限制修饰系统的分析

2．3．5 B．amyloliquefaciens LL3基因组代谢通路相关分析

2．3．6 B．amyloliquefaciens LL3基因组中插入序列和原噬菌体相关基因分析

2．3．7 B．amyloliquefaciens LL3基因组中编码跨膜蛋白的特征

第四节 本章小结

第三章 ε-PL合成菌株分离、鉴定和发酵研究

第一节 引言

第二节 实验材料和方法

3．2．1 土壤样品

3．2．2 试剂与耗材

3．2．3 主要仪器与设备

3．2．4 ε-PL合成菌株的分离

3．2．5 ε-PL合成菌株的种属鉴定

3．2．6 ε-PL合成菌株的的发酵、产物提取和结构鉴定

3．2．7 ε-PL合成菌株S．albulus NK660的发酵条件优化和30 L体系发酵研究

第三节 实验结果与讨论

3．3．1 ε-PL合成菌株分离和鉴定

3．3．2 ε-PL合成菌株的摇瓶发酵及产物的结构鉴定

3．3．3 S．albulus NK660发酵条件的优化和30L体系的发酵研究

第四节 本章小结

第四章 Streptomyces albulus NK660相关分子生物学研究

第一节 引言

第二节 实验材料和方法

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 培养基和试剂

4．2．3 工具酶和试剂盒

4．2．4 实验仪器和软件

4．2．5 Steptomyces albulus NK660中ε-PL合成酶基因的克隆

4．2．6 ε-PL合成酶基因在S．lividans中的异源表达

4．2．7 Streptomyces albulus NK660中表达透明颤菌血红蛋白VHb

第三节 结果和讨论

4．3．1 Streptomyces albulus NK660 ε-PL合成酶基因的克隆

4．3．2 Steptomyces albulus NK660 ε-PL合成酶的异源表达

4．3．3 在Streptomyces albulus NK660中表达VHb对ε-PL合成的影响

第四节 本章小结

第五章 结论与展望

第一节 全文总结

第二节 展望

参考文献

致谢

附录

个人简历及在学期间发表的论文