光帽鳞伞抗肿瘤蛋白分离纯化与表达及其作用机制研究

摘要

目前恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一，但是现有的放疗和化疗药物因疗效有限、毒副作用和耐药性等问题在临床应用上受到限制，因此探索新的高效低毒的天然抗肿瘤药物具有重要的研究意义和良好的应用前景。本研究通过SP阳离子交换层析和Superdex凝胶过滤层析，从光帽鳞伞中分离纯化得到一种新的抗肿瘤蛋白PNAP。SDS-PAGE与超速离心测定该蛋白的相对分子质量约为18.5KDa，Edman降解法测得其N-端10个氨基酸序列为AGRTFIGYNG。生物活性测定显示PNAP对乳腺癌细胞MCF7与宫颈癌细胞HeLa具有抗增殖作用，IC50分别为9.97μM和12.11μM。在研究PNAP是否具有HIV-1整合酶抑制活性的试验中，发现PNAP具有脱氧核糖核酸酶活性，能够作用于双链与单链DNA，但对双链DNA的作用更明显，其最适pH为5.0，最适温度为60℃。
　　在PNAP抗肿瘤作用机制的研究中，首先以MCF7细胞为模型检测PNAP抗肿瘤细胞增殖作用，发现PNAP作用于肿瘤细胞MCF7后可引起典型的形态学变化如染色体固缩和线粒体膜电位降低等，还可引起细胞周期阻滞，Sub-G1期细胞比例增多，揭示PNAP抑制肿瘤细胞增殖可能与诱导细胞凋亡有关。通过Western blot法检测细胞凋亡信号通路中蛋白的表达水平，发现PNAP诱导细胞凋亡引起了细胞色素c的释放、caspase-9和caspase-3的激活，表明PNAP可以通过内部线粒体信号途径诱导细胞凋亡;同时发现Fas和caspase-8的表达水平得到了提高，表明PNAP也可以通过体外死亡受体信号途径诱导肿瘤细胞凋亡;另外PNAP作用于MCF7细胞还可引起Bcl-2家族蛋白的变化。
　　接着以乳腺癌移植瘤BALB/c小鼠为模型检测PNAP体内抗肿瘤作用，发现PNAP对小鼠乳腺癌具有抑制作用。胰酶消化乳腺癌细胞MCF7细胞后，以107/ml细胞浓度皮下注射小鼠，当肿瘤体积达到100-200mm3时，小鼠连续给药14天后处死，肿瘤抑制率为46.09％，说明PNAP在体内具有抗乳腺癌作用，对体内肿瘤组织有显著抑制作用。HE染色分析肿瘤组织病理切片，发现PNAP能够引起小鼠体内乳腺癌细胞的凋亡。另外，PNAP具备免疫调节能力，PNAP给药后，与PBS对照组相比，肿瘤小鼠脾细胞中的免疫调节因子IL-2和IFN-γ的mRNA含量明显的提高，IL-4、IL-10和TNF-α的mRNA含量降低，而对于IL-6则无显著作用。肿瘤小鼠经PNAP处理后小鼠体内免疫调节因子Th1/Th2平衡向Th1偏移，使得小鼠免疫系统得到一定的恢复，机体处于抗肿瘤状态。同时，PNAP还具有抗氧化活性，能够有效抑制脂质过氧化和清除羟基自由基与DPPH自由基，对癌症的预防与治疗能够起到积极的作用。
　　最后，为了使PNAP能够广泛应用，对PNAP蛋白进行了重组表达。首先通过RT-PCR的方法获得PNAP基因，然后将其克隆到表达载体pET-MBP中，继而在大肠杆菌中进行表达。融合蛋白经麦芽糖亲和色谱纯化后，TEV酶切去除MBP标签蛋白，最后通过Superdex凝胶过滤层析获得重组PNAP。生物活性分析表明，重组PNAP具有一定的抗肿瘤活性，但其活性比天然PNAP低。对融合蛋白MBP-PNAP在大肠杆菌中的表达条件进行了优化，最佳条件为:培养温度30℃，在对数生长期中期(OD600=0.8)加入0.3 mM IPTG，诱导表达6h，融合蛋白的表达量可达16.3mg/L，解决了天然PNAP含量低及分离纯化困难等问题，为其广泛应用奠定了基础。
　　综上所述，本研究首先从光帽鳞伞中分离纯化得到一个新的抗肿瘤蛋白PNAP，发现PNAP抑制肿瘤细胞增殖与诱导细胞凋亡有关，线粒体信号通路和死亡受体信号通路都参与了PNAP诱导的细胞凋亡;PNAP在体内同样具有抗乳腺癌的作用，可以诱导小鼠体内乳腺癌细胞凋亡;PNAP具备免疫调节能力，PNAP处理荷瘤小鼠后促使Th1/Th2平衡向Th1方向漂移，使机体处于抗肿瘤状态;同时，PNAP具有抗氧化能力，对肿瘤的预防与治疗具有积极作用。PNAP作用机制的研究将为其临床应用提供理论依据。接着通过在大肠杆菌中重组表达PNAP，确定异源表达的正确性和抗肿瘤活性后，进一步优化重组菌发酵条件，提高重组表达产量，为获得PNAP晶体结构并从结构与功能方面研究其作用机制奠定了基础，同时也为该抗肿瘤蛋白的广泛应用和进入临床试验提供可能。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 大型真菌蛋白的抗肿瘤作用

1．1．1 大型真菌蛋白的抗肿瘤活性研究概况

1．1．2 光帽鳞伞研究概况

第二节 大型真菌蛋白抗肿瘤分子机理

1．2．1 细胞凋亡与肿瘤治疗

1．2．2 免疫调节与肿瘤抑制

1．2．3 肿瘤抑制与自由基代谢

第三节 基因工程药物蛋白

1．3．1 大肠杆菌表达系统

1．3．2 大型真菌药用蛋白表达概况

第四节 选题依据与研究意义

第二章 光帽鳞伞抗肿瘤蛋白的分离纯化

第一节 引言

第二节 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

第三节 实验结果

2．3．1 光帽鳞伞蛋白的分离纯化

2．3．2 生物活性测定

2．3．3 光帽鳞伞PNAP的鉴定

第四节 分析与讨论

2．4．1 光帽鳞伞抗肿瘤蛋白PNAP的分离纯化

2．4．2 PNAP生物活性鉴定

2．4．3 PNAP的分子量和N端序列鉴定

第三章 PNAP的抗肿瘤作用机制

第一节 引言

第二节 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验步骤

第三节 实验结果

3．3．1 PNAP诱导肿瘤细胞凋亡

3．3．2 PNAP对BALB／c小鼠MCF7移植瘤的抑制作用

3．3．3 PNAP对肿瘤小鼠免疫调节因子的影响

3．3．4 PNAP的抗氧化作用

第四节 分析与讨论

3．4．1 细胞凋亡与肿瘤抑制

3．4．2 免疫调节与肿瘤抑制

3．4．3 抗氧化与肿瘤抑制

第四章 重组抗肿瘤蛋白的表达与优化

第一节 引言

第二节 实验方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验步骤

第三节 实验结果

4．3．1 RT-PCR获得PNAP基因

4．3．2 PNAP基因序列测定

4．3．3 生物信息学预测

4．3．4 MBP-PNAP的融合表达与纯化

4．3．5 质谱鉴定

4．3．6 重组PNAP的抗肿瘤活性分析

4．3．7 重组PNAP脱氧核糖核酸酶活性

4．3．8 重组PNAP抗氧化活性

4．3．9 重组菌表达条件优化

第四节 分析与讨论

4．4．1 目的基因克隆与生物信息学预测

4．4．2 重组蛋白的表达

第五章 结论与展望

第一节 结论

第二节 展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果