G-四链体的稳定性、构型竞争及在端粒酶活性检测中的研究

摘要

G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA序列形成的一种特殊的核酸二级结构，有望形成G-四链体的基因序列广泛存在于人类基因组的许多重要区域。近年来，围绕G-四链体，人们开展了大量的研究工作，包括 G-四链体DNA酶的研究、G-四链体的构型研究及G-四链体特异性配体的研究等。围绕G-四链体，本文开展了如下三方面的工作：基于G-四链体-hemin DNA酶的端粒酶活性检测；分子拥挤条件下pH对单个DNA链中G-四链体与二倍体结构竞争的影响研究；用于G-四链体熔点检测的染料筛选实验。
　　本研究主要内容包括：⑴端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能延伸人类染色体端粒重复序列（5′-GGGTTA-3′）。由于其与癌细胞的无限增殖密切相关，所以成为抗癌药物设计的新靶点。直到目前端粒酶活性检测方法的研究仍然是一个热点。设计了一种简单高效、不需要聚合酶链式反应（PCR-free）的端粒酶活性检测方法。这种方法基于端粒酶诱导G-四链体-氯化血红素（hemin）DNA酶的形成。实验中使用了一种短的、无标记的端粒酶引物。由于这个引物只包含3个连续GGG重复序列，所以不能形成稳定的G-四链体。在活性端粒酶和G碱基（dGTP）的存在下，一个连续GGG重复序列可以被加到引物链的3′-端。被延伸的引物可以折叠成G-四链体，G-四链体可以与hemin结合成具有高效催化活性的G-四链体-hemin DNA酶，这种酶可以催化过氧化氢（H2O2）氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）生成绿色的 ABTS·+。由于引物延伸反应生成的产物很短，端粒酶表现出高的周转率，因此提高了方法的灵敏度。用这种方法能够检测到来自200个HeLa细胞的端粒酶活性。⑵人类基因组中存在着大量有望形成G-四链体的富G基因序列。但除染色体末端的单链端粒区域外，绝大多数富 G序列都是与其互补序列共同存在的。这就意味着这些区域内可能存在有 G-四链体与二倍体结构的竞争作用。考虑到基因组中二倍体结构的形成过程更接近于一个分子内的过程，且细胞内处于一个非常拥挤的环境，我们将富G序列及与其互补的富C序列连接成一条DNA链，以40％（v/v）的聚乙二醇200（PEG200）来模拟细胞内的拥挤环境，用荧光光谱、圆二色（CD）光谱及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的方法，对稀释和分子拥挤条件下，pH值对G-四链体与二倍体的竞争作用进行了比较研究。研究结果表明，在稀释条件下，富G序列主要被包埋在二倍体结构当中，且pH值的变化（5.8~8.0）不会对DNA的结构造成影响。而在分子拥挤条件下，酸性环境有利于二倍体结构的形成；pH值的增大促使二倍体结构向G-四链体结构转化，转化过程主要发生在pH值6.7~7.4之间。这一研究结果可以为探讨某些基因序列的生理功能、阐明一些疾病的发病机理及以这些富G序列为靶进行相关药物的研制提供必要的信息。⑶G-四链体的熔点（Tm）可以用来衡量G-四链体的热稳定性。很多关于G-四链体的研究中都会涉及到G-四链体熔点的测定。发展一种适合高通量测定的、免标记的G-四链体熔点测定方法对于大批量研究G-四链体具有重要的意义。某些染料的荧光对G-四链体结构有高度的依赖性。它们自身没有荧光或者荧光很弱，但是与G-四链体结合后荧光会增强。因此，我们希望找到可以用于检测G-四链体熔点的荧光染料。实验通过对荧光染料进行筛选，筛选出了SYBR Green I这种荧光染料。并将其应用于G-四链体的熔点测定。通过将测定结果与紫外光谱、CD光谱、分子信标荧光探针测得的结果进行比较，发现在高浓度钾离子中能得到满意的结果；在各个浓度的钠离子中，测得的结果与紫外和CD的结果相差一个定值，通过校准也可以得到满意的结果。但是还需要将SYBR Green I应用于更多的DNA以检验其准确性。而且在钠离子和低浓度的钾离中，SYBR Green I测得的结果偏高，所以还需要进一步对染料进行筛选，选出更满意的荧光染料。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 绪论

第一节 G-四链体简介

1.1.1 G-四链体结构

1.1.2 G-四链体构型的多态性

1.1.3 G-四链体的生物功能

第二节 端粒酶活性检测方法

1.2.1 G-四链体-hemin DNA酶简介

1.2.2 端粒酶活性的检测方法

第三节G-四链体和其他DNA结构之间的竞争

1.3.1 分子拥挤效应

1.3.2 分子拥挤效应对G-四链体的影响

1.3.3 G-四链体和其他DNA结构之间的竞争

第四节 G-四链体熔点测定方法

1.4.1 紫外光谱测定熔点

1.4.2 利用G-四链体分子信标荧光探针测定熔点[121]

1.4.3 CD光谱测定熔点

第二章 基于G-四链体-hemin DNA酶的端粒酶活性检测

第一节 实验部分

2.1.1 仪器与试剂

2.1.2 端粒酶提取物的制备

2.1.3 端粒酶活性检测

2.1.4 PAGE凝胶电泳实验

第二节 结果和讨论

2.2.1 端粒酶活性检测的实验原理

2.2.2 端粒酶引物链的设计

2.2.3 端粒酶检测条件的优化

2.2.4 细胞提取物中端粒酶活性的定量

第三节 结论

第三章 分子拥挤条件下pH对单个DNA链中G-四链体与二倍体结构竞争的影响研究

第一节 实验部分

3.1.1 仪器与试剂

3.1.2荧光光谱研究

3.1.3 CD光谱研究

3.1.4 PAGE凝胶电泳实验

第二节 结果与讨论

3.2.1 荧光光谱研究

3.2.2 CD光谱研究

3.2.3 动力学实验

3.2.4 PAGE凝胶电泳实验

第三节 结论

第四章 用于G-四链体熔点检测的染料筛选实验

第一节 实验部分

4.1.1 仪器与试剂

4.1.2 染料的筛选

4.1.3 SYBR Green I与G-四链体Hum27和单链DNA的荧光光谱测定

4.1.4 利用SYBR Green I测定G-四链体Hum27熔点

4.1.5利用紫外吸收信号测定G-四链体Hum27熔点

4.1.6利用荧光标记探针测定G-四链体Hum27熔点

4.1.7 利用CD信号测定G-四链体Hum27熔点

第二节 结果与讨论

4.2.1 染料的筛选

4.2.2 SYBR Green I与G-四链体Hum27和单链DNA的荧光测定

4.2.3 利用SYBR Green I测定G-四链体Hum27的熔点

4.2.4 利用紫外信号测定G-四链体Hum27的熔点

4.2.5 利用荧光标记探针测定G-四链体Hum27熔点

4.2.6 利用CD信号测定G-四链体Hum27熔点

4.2.7 熔点数据整理与分析

第三节 结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果