人源线粒体核糖核酸酶MRPP复合物的结构与功能研究

摘要

tRNA在生物信息的传递中起着重要的作用，它能够将DNA上的遗传信息通过信使RNA传递到蛋白质上，是信使RNA的解码适配器。在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行一系列的加工和修饰进而形成成熟的tRNA。核糖核酸酶P就是一种金属核酸酶，能够在 Mg2+或其他二价金属离子存在的条件下对 tRNA前体进行水解，产生带有3′羟基的5′-RNA前导序列和带有5′磷酸基团的3′-tRNA。核糖核酸酶P存在于所有的生命体中都，一般都是由一个RNA加上数量不等的蛋白质分子构成。然而，最近发现人源线粒体中其核糖核酸酶 P是仅由三种蛋白质成分组成的不含RNA成分的MRPP复合物。
　　MRPP复合物由三种蛋白组成，分别是MRPP1、MRPP2和MRPP3。其中MRPP1属于TRMT10家族，是一种甲基转移酶，能对人源线粒体中tRNA的第九位核苷酸进行甲基化修饰，然而tRNA中第九位核苷酸的修饰对于tRNA的5′序列得加工来说不是必须的。目前，MRPP1在线粒体tRNA加工中的作用仍然不清楚。MRPP2是具有多种功能的蛋白，它属于短链脱氢酶家族的一员，但它脱氢酶的活性在tRNA加工中也不是必须的。MRPP2与Aβ有较高的亲和力，可能是阿尔茨海默病的治疗的一个重要靶标。MRPP3是这个复合物中的第三个成员，也是担任着催化功能的重要亚基。MRPP3由三个结构域组成，包括与tRNA底物的结合和识别相关的PPR结构域，中央结构域和金属核酸酶结构域。MRPP3与存在于植物线粒体和叶绿体中的核糖核酸酶 PRORP1具有较高的同源性， PRORP1单独可以加工 tRNA前体，但是 MRPP3在水解底物时则必须需要MRPP1和MRPP2的帮助。
　　本研究成功的在体外重组表达了人源线粒体核糖核酸酶这个三元复合物，以人源线粒体的转运RNA前体为底物在体外验证了这个复合物的核糖核酸酶活性。并对MRPP1和MRPP2两个亚基进行了共表和纯化，尝试了一系列的截短和突变进行这个二元复合物晶体的生长实验，为后续解析MRPP1和MRPP2复合物的结构提供了基础。
　　本研究成功的解析了MRPP复合物中催化亚基MRPP3-C的晶体结构，通过与同源结构PRORP1的比较和对转运RNA底物加工实验的验证，发现MRPP3以自抑制形式存在，这种构象不利于水解反应中所必需的二价金属离子的结合，所以推测MRPP3需要其他亚基的帮助来打破这种自抑制的构象，使金属离子能够结合进来才能够进一步水解底物。MRPP3结构的解析及自抑制位点的发现为以后研究MRPP复合物的催化机制提供了重要的依据,也为研究核糖核酸酶的进化提供了重要信息。

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符号说明

第一章 前言

第一节 tRNA的生成

第二节 核糖核酸酶的研究进展

第三节 人源线粒体核糖核酸酶MRPP复合物的介绍

第四节 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 试验方法

第三章 MRPP复合物中催化亚基MRPP3的结构解析

第一节 MRPP复合物中催化亚基MRPP3的生物信息学分析

第二节 MRPP3的全长的克隆与表达

第三节 MRPP3截短的表达与结晶

第四节 MRPP3硒代衍生物的纯化与结晶与数据收集

第五节 MRPP3晶体的数据处理和结构解析

第四章 MRPP3的结构与功能分析

第一节 MRPP3-C整体结构的分析

第二节 MRPP3自抑制位点的发现与分析

第三节 构建嵌合体蛋白验证MRPP3自抑制构象

第五章 MRPP1和MRPP2的表达纯化结晶尝试

第一节 MRPP1及MRPP2的基本信息预测

第二节 MRPP1及MRPP2的表达纯化尝试

第三节 MRPP1及MRPP2的共结晶尝试

第四节 MRPP1与MRPP2的其他截短及突变

第六章 结果和讨论

第七章 E.coli糖基转移酶WbnH以近似活性状态存在

第一节 引言

第二节 结果与讨论

参考文献

致谢

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