建立定量乙酰化蛋白质组的质谱分析方法

摘要

人们已经发现包括甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化在内的超过200种不同类型的蛋白质翻译后修饰（PTM），其中许多修饰的异常调节与细胞衰老和疾病如癌症、心血管疾病等密切相关。研究它们的多样性对于理解疾病发生机制乃至发现药物治疗靶点非常重要。尽管有证据阐明这些修饰的蛋白会影响细胞功能，但是由于研究方法的限制，仍然还有大量修饰的底物和修饰位点是不清楚的。因而对现有的研究方法不断改进和创新是十分有必要的。
　　乙酰化修饰是细胞生物调节蛋白质发挥生物学功能的重要翻译后修饰。大量的研究发现，乙酰化在控制细胞代谢[1]、蛋白折叠、姊妹染色单体的结合中起着重要作用。还发现乙酰化具有调节热量限制的有利效果，即延缓衰老的不用绝食的低营养摄入[2]。研究也证明乙酰化的功能角色从酵母到哺乳动物都是进化上保守的。
　　酿酒酵母是一种广泛应用于研究的模式生物，它含有一些进化上保守的赖氨酸乙酰化转移酶和去乙酰化酶，因此非常适合作为乙酰化修饰的研究对象。本研究不仅有助于发现乙酰化修饰在应激反应和代谢调控中扮演的角色，而且还将有助于深入研究乙酰化修饰在诸如肿瘤等疾病发生发展中的重要作用，并有助于发现新的药物治疗靶点以及研制抗肿瘤药物，如最近报道的FDA批准上市的Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶口服抑制剂西达苯胺[3]。
　　本课题针对乙酰化修饰，优化了样品制备和数据分析流程，建立了基于酵母体系的双甲基标记定量乙酰化蛋白质组的分析流程，总共鉴定到362个高度可信的乙酰化蛋白以及846个乙酰化位点。并且在两个菌株定量比较中发现了3个显著差异表达的乙酰化蛋白和修饰位点，分别是PAA1的K176，ENO1的K346，SSE2的K627。进一步的研究将有助于阐明这三个乙酰化位点在酵母体内的功能。图15幅，表4个，参考文献99篇。

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第一章 引言

第一节 蛋白质赖氨酸翻译后修饰及其研究现状

1.1.1 赖氨酸甲基化及其研究现状

1.1.2 赖氨酸乙酰化及其研究现状

1.1.3 其它赖氨酸酰化及其研究现状

第二节 蛋白质组定量方法

1.2.1 SILAC标记定量方法

1.2.2 iTRAQ标记定量方法

1.2.3 Dimethyl标记定量方法

1.2.4 Lable Free定量方法

第三节 乙酰化修饰研究成果的临床应用

第四节 论文研究内容及其目的和意义

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌种来源

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 液质联用质谱耗材以及数据分析软件

2.1.5 试剂配方

第二节 实验原理与方法

2.2.1 酵母菌的培养

2.2.2 酵母菌生长曲线与产乙醇能力测定

2.2.3 酵母全蛋白提取

2.2.4 蛋白浓度测定

2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.6 免疫印迹技术

2.2.7 蛋白样品酶解原理与步骤

2.2.8 双甲基标记定量方法

2.2.9 乙酰化肽段的免疫沉淀

2.2.10 质谱分析

2.2.11 乙酰化蛋白及其位点鉴定参数设置

2.2.12 蛋白质组定量参数设置

2.2.13 乙酰化肽段及其位点定量参数设置

第三章 实验结果与讨论

第一节 酿酒酵母生长情况评价

第二节 全蛋白质组提取

第三节 乙酰化蛋白及其位点的鉴定结果与分析

3.3.1 乙酰化蛋白鉴定的实验流程

3.3.2 乙酰化蛋白鉴定结果

3.3.3 乙酰化蛋白GO富集分析

3.3.4 乙酰化位点的分布

3.3.5 代谢途径中的乙酰化蛋白

第四节 乙酰化蛋白组定量结果与分析

3.4.1 双甲基标记定量方法比较

3.4.2 乙酰化蛋白定量实验流程

3.4.3 蛋白组定量结果与分析

3.4.4 乙酰化蛋白组定量结果与分析

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历