细菌介导TALEN技术在基因组靶向修饰中的应用

摘要

转录激活因子样效应分子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)是一类新型的基因靶向修饰核酸酶，是目前最具发展前景的基因修饰技术之一，是真核细胞基因修饰领域中的里程碑。该新型核酸酶TALEN能够以二聚体的形式特异性地识别并切割靶DNA序列，产生DNA双链断裂，激活宿主细胞的修复系统，导致在靶基因处发生非同源末端连接或同源重组反应，从而达到基因修饰的目的。然而，目前在应用该新型核酸酶TALEN进行基因修饰时，其导入的方法多涉及到引入外源遗传物质，由于外源遗传物质的引入，使得该方法存在潜在的插入整合突变的危险。另外，TALEN基因在宿主细胞中持续性的表达增加了非特异性的DNA切割反应，从而引入意外的基因突变。因此，迫切需要开发全新的安全的TALEN导入方法应用于基因修饰领域中。
　　铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一类广泛存在于环境中的人类条件性致病细菌，具有针状复合结构的Ⅲ型蛋白分泌系统，通过该分泌系统能够将胞内毒力蛋白在其N端信号肽的主导下高效地注入到宿主细胞体内，因此，该Ⅲ型分泌系统将为外源蛋白导入宿主细胞内提供了天然的工具。
　　本论文中，首先开发了一种利用铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统介导的TALEN蛋白导入到宿主细胞的方法。利用铜绿假单胞菌低毒力菌株PAKΔSTY，将与Ⅲ型分泌系统毒力蛋白ExoS的N端54个氨基酸相融合的TALEN蛋白有效地导入到人类癌细胞HeLa细胞系中，并成功地定位到宿主细胞核中，注入胞内的TALEN蛋白可持续发挥作用12个小时，之后在胞内自动被降解。利用该细菌介导的基因修饰技术，成功地将整合在HeLa细胞基因组上的荧光基因venus敲除，通过流式细胞仪检测荧光强度，得到其效率约为10％。进一步分别通过细胞同步化和多次细菌导入TALEN的方法，有效地将基因修饰效率提高到20%。该细菌介导的TALEN蛋白导入技术不仅能够在哺乳动物细胞内正确地进行靶向基因组修饰，而且可以通过细菌侵染计量、侵染次数和细胞同步化等因素调节其效率。
　　对干细胞基因组的靶向修饰是细胞治疗和基因治疗领域中的关键技术，也是生物医学研究领域的热点问题。在疾病研究和治疗中，干细胞基因组的精确修饰是研究基因型和表型关系的关键，是建立疾病模型的重要工具。因此，将细菌介导的 TALEN蛋白注入技术应用在干细胞基因组上精确点突变修饰中，具有重要意义。本论文利用细菌介导TALEN基因修饰技术成功且高效地对鼠胚胎干细胞，人胚胎干细胞和人诱导多功能干细胞进行了靶向基因修饰。首先，通过该技术分别在鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞中敲除了gfp基因，同时在人诱导多功能干细胞中敲除了位于X染色体上的人类莱-尼综合征疾病相关基因HPRT1。其次，通过联合细菌介导的TALEN蛋白注入和导入同源DNA模板技术，在鼠胚胎干细胞基因组靶位点处精确地引入单碱基突变，将表达gfp基因的鼠胚胎干细胞转变为gfp敲除细胞，再通过同样的方法，将gfp敲除细胞转变回表达gfp基因的细胞系。利用该细菌介导的基因精确修饰技术所得到的靶位点点突变效率(20%)高于传统的DNA转染方法(10%)。最后，利用该细菌介导的基因精确修饰技术在人类诱导多功能干细胞中，成功地在莱-尼综合征疾病相关基因HPRT1中引入了点突变，为莱-尼综合征疾病模型的建立奠定了基础。
　　本论文进一步拓展了铜绿假单胞菌III型分泌系统的应用，为利用该细菌的蛋白导入系统进行干细胞分化调控的研究打下基础，为基因修饰和人类疾病治疗领域，提供了一种安全、高效、简单的替代性技术。

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第一章 引言

第一节 铜绿假单胞菌及其毒力

第二节 铜绿假单胞菌的III型蛋白分泌系统

第三节 铜绿假单胞菌的III型蛋白分泌系统效应因子ExoS

第四节 转录激活因子样效应分子核酸酶的介绍及应用

第五节基因治疗的策略、方法及技术

第六节 基因点突变的研究意义及研究技术

第七节 本论文的研究意义目的及研究路线

第二章 细菌介导TALEN蛋白对人类基因组的修饰

第一节 材料与方法

第二节结果

第三节 讨论

第四节小结

第三章 细菌介导 TALEN 蛋白对鼠胚胎干细胞基因组的修饰

第一节 材料与方法

第二节结果

第三节讨论

第四节小结

第四章 细菌介导TALEN蛋白对人类多功能干细胞基因组的修饰

第一节 材料与方法

第二节结果

第三节 讨论

第四节 小结

第五章 结论

展望

附录

参考文献

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果