抗原决定簇表面分子印迹制备用于选择性提取多肽及蛋白的人工抗体

摘要

分子印迹技术是一种制备对于印迹分子具有识别能力的材料合成技术。由于具有高选择性和环境耐受能力以及制备方便，分子印迹聚合物已经被广泛应用于分离科学，传感以及催化等研究领域。近年来，随着生命科学的发展，蛋白后修饰研究成为热点，生物样品中标记蛋白和多肽的测定成为研究中的重要内容，作为人工抗体，分子印迹聚合物也在多肽和蛋白的选择性提取方面显示了优越性。但是由于蛋白分子尺寸大、结构复杂、构象灵活性，并且只能溶于水溶液，对于蛋白类生物大分子的印迹仍存在一定的困难，表面印迹技术和抗原决定基的方法为解决这个问题开辟了新的途径。本文结合限于表面的分子印迹和抗原决定簇的方法，进行了组蛋白H4K16乙酰化标记物和β2-微球蛋白的分子印迹聚合物合成、评价及应用研究。合成中，选择作为抗原决定簇的多肽为模板，以硅胶为牺牲基质，在接枝抗原决定簇的硅胶表面进行聚合反应后除去硅胶，得到了结合位点位于材料表面的印迹微球，材料评价实验结果说明，印迹微球具有很高的识别性能及抗原决定簇亲和能力，可以应用于实际样品中目标分子的选择性提取。
　　本研究主要内容包括：⑴阐述了蛋白质分子印迹技术的发展现状、抗原决定簇印迹的优点、印迹聚合物在生物样品中标记物分离中的重要性以及本研究的意义。⑵组蛋白H4K16乙酰化标记物分子印迹聚合物的合成、评价及应用。组蛋白H4 K16(简称为H4-K16)的乙酰化修饰对于染色体中的组装、细胞的周期调控等有着重要作用，对于H4-K16乙酰化(H4-K16ac)的分析具有重要的意义。研究中选择组蛋白H4K16乙酰化的标志多肽段作为印迹分子，通过表面印迹和抗原决定簇的方法，合成了对于 H4-K16ac具有特异性识别能力的人工抗体(GGAKacR-MIP)。平衡吸附试验和液相色谱的结果表明，GGAKacR-MIP具有很好的识别性能，不仅可以区别与印迹分子有一个氨基酸差别的多肽、能够区别氨基酸侧链的差异，也可以识别包含抗原决定簇的长链多肽。以加标组蛋白酶解液为样品、印迹聚合物为萃取材料，以 MALDI-TOF和 HPLC方法进行了应用能力的评价。结果说明，经过 GGAKacR-MIP吸附后，印迹多肽和含抗原决定簇的长链多肽被选择性富集，样品被净化，经计算目标多肽的回收率均为80％以上。结果说明GGAKacR-MIP可以被应用于实际样品中的H4K16乙酰化标记物和含有相同抗原决定簇的多肽的富集中。⑶表面印迹和抗原决定簇的方法合成特异性识别β2-微球蛋白的人工抗体。β2-微球蛋白（β2-MG）是人体白细胞抗原的一个β轻链，也被作为一种肿瘤的标志物，建立其在生物样品中更为方便、准确的测定方法很有意义。本研究进行了识别β2-微球蛋白的人工抗体合成实验。选择β2-微球蛋白C端的九个氨基酸作为印迹的模板分子进行了印迹合成。选择性实验结果表明，所合成的印迹聚合物具有很好的识别性能。以九肽为模板所合成的印迹材料可以识别分子量为11K的β2-MG，并且可以区别其它蛋白质分子，具有很好的选择性，具有在实际样品中选择性富集目标蛋白的应用潜力。

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第一章 绪论

第一节 分子印迹技术

1.1.1 分子印迹技术概述

1.1.2 分子印迹技术的制备方法

1.1.3 分子印迹技术的应用

第二节 蛋白质及多肽分子印迹

1.2.1 蛋白质分子印迹的意义

1.2.2 蛋白类生物大分子印迹研究的挑战性

1.2.3 蛋白类生物大分子印迹方法研究

第三节 蛋白质分析在生命科学研究中的应用

1.3.1 用于癌症标志物的蛋白

1.3.2 组蛋白乙酰化修饰

1.3.3 β2-微球蛋白

第四节 课题提出内容及意义

参考文献

第二章 以抗原决定簇表面印迹制备分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球

第一节 引言

第二节 实验部分

2.2.1 实验仪器、原料与试剂

2.2.2 硅胶表面接枝双官能团戊二醛

2.2.3 在硅胶表面键合模板多肽

2.2.4 分子印迹聚合物微球的合成

2.2.5 平衡吸附法测定GGAKacR-MIP结合性能

2.2.6 竞争吸附法测定GGAKacR-MIP选择性能

2.2.7 动力学吸附曲线

2.2.8 液相色谱法测定GGAKacR-MIP的选择性

2.2.9 GGAKacR-MIP应用于组蛋白酶解液中乙酰化肽段的富集

第三节 结果与讨论

2.3.1 聚合物的合成方法及合成条件的优化

2.3.2 印迹微球的形貌分析

2.3.3 傅里叶红外FT-IR表征

2.3.4 元素分析

2.3.5 GGAKacR-MIP和GGAKacR-NIP的等温吸附实验和Scatchard分析

2.3.6 GGAKacR-MIP和GGAKacR-NIP的动力学吸附试验

2.3.7 GGAKacR-MIP和GGAKacR-NIP的特异性识别实验

2.3.8 GGAKacR-MIP和GGAKacR-NIP的竞争性吸附试验

2.3.9 GGAKacR-MIP和GGAKacR-NIP的液相色谱行为

2.3.10 流动相条件对固定相 GGAKacR-MIP 和 GGAKacR-NIP 保留特性的影响

2.3.11 GGAKacR-MIP 印迹聚合物应用于加标组蛋白酶解液中目标多肽的分离富集

第四节 结论

参考文献

第三章 以抗原决定簇表面印迹制备分离β2-微球蛋白的分子印迹微球

第一节 引言

第二节 实验部分

3.2.1 实验仪器、原料与试剂

3.2.2 活化硅胶

3.2.3 硅胶表面接枝氨基

3.2.4 硅胶表面接枝模板多肽

3.2.5 分子印迹聚合物微球的合成

3.2.6 平衡吸附法测定MIQRTPKIQ-MIP结合性能

3.2.7 竞争吸附法测定MIQRTPKIQ-MIP选择性能

3.2.8 动力学吸附试验

3.2.9 液相色谱法测定MIQRTPKIQ-MIP的选择性

第三节 结果与讨论

3.3.1 印迹微球的表观形貌分析

3.3.2 分子印迹聚合物的溶胀情况

3.3.3 元素分析

3.3.4 傅里叶红外（FT-IR）表征

3.3.5 平衡吸附法选择功能单体

3.3.6 等温吸附及Scatchard分析

3.3.7 动态吸附

3.3.8 分子印迹聚合物的选择性

3.3.9 MIP和NIP的液相色谱行为

3.3.10 通过调节流动相来分析识别机理

第四节 结论

参考文献

致谢

个人简历及在学期间发表的学术论文