负载双重生长因子的天然多糖支架在肝组织工程中的应用

摘要

厚组织工程的构建是一个十分复杂的过程，以肝组织工程为例，不仅要求细胞支架具有优异的肝细胞亲和能力以促进肝组织生成并保持其生理活性，还需要支架中具有血管网络从而给新生肝组织的生长提供氧气、养分等物质并清除代谢产物等。在此过程中涉及多种活性因子的协同、依次起效，因此如何控制不同因子的释放时限就成为了肝组织工程支架研究中的关键问题之一。本文以天然多糖衍生物为基质材料，分别通过物理吸附及共价键连的方式在支架中负载具有诱导血管新生以及肝细胞亲和能力的生长因子，制备了一种负载双重生长因子的新型活性水凝胶材料，从而同时满足支架内血管网络的快速生成以及肝组织长期生长的需要。
　　本文首先将肝细胞生长因子（ HGF）与双官能化光敏交联分子sulfo-SANPAH(SS)反应制备光敏化生长因子SS-HGF，通过紫外确认了SS-HGF的合成成功。然后通过SS-HGF的光敏性叠氮苯基将生长因子共价键连至壳聚糖硫酸酯（SCSTS）以获得负载有 HGF的活性二维表面（SCTS-HGF）。多功能电子能谱（XPS）及酶联免疫吸附试验（ELISA）结果表明，该反应成功且 HGF表面修饰量约为7.4ng/cm2。之后，在二维水平上通过MTT检测法、免疫荧光染色以及尿素氮测试法考察了不同材料对 HepG2细胞的黏附、铺展、增殖以及代谢等行为的影响。结果显示共价键连 HGF的材料可显著促进 HepG2的黏附和增殖并维持肝细胞的正常功能，其活性与游离态 HGF间无显著性差异，并且固定化 HGF在长效培养中显示出更为优异的稳定性。在二维水平的研究基础上，进而通过辣根过氧化酶/过氧化氢（HRP/H2O2）催化制备了SCTS水凝胶，然后通过物理吸附的方法向其中负载促进血管新生的血管内皮生长因子（VEGF）；通过光致化学键连的方法向其中负载促进肝细胞生长的HGF，然后通过ELISA实验考察两种不同方式负载的生长因子在水凝胶中的释放行为。结果表明，物理吸附的VEGF实现了快速大量的释放，在4天内累积释放量已达到90％，而共价键连的HGF相比之下则并无明显的释放现象，且在长达28天内累积释放量一直维持在同一水平。最后，直接将HepG2细胞接种于负载不同生长因子的SCTS水凝胶支架内，采取体外三维培养的方法考察该活性水凝胶作为肝组织工程支架材料的可行性。通过对支架材料中 HepG2细胞尿素合成量的测定及细胞形态的观察来考察肝细胞功能。结果显示，共价键连 HGF的引入显著促进了细胞的尿素合成水平及细胞球状聚集体的形成。

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第一章 绪论

第一节 肝组织工程

第二节 负载协同信号并程序性起效的组织工程

第三节 生长因子的负载方法

第四节 课题提出

参考文献

第二章 SCTS及光敏化HGF材料的制备与表征

第一节 引言

第二节 实验部分

第三节 结果与讨论

第四节 本章小结

参考文献

第三章 负载HGF的活性SCTS表面的制备及其对HepG2细胞行为的影响

第一节 引言

第二节 实验部分

第三节 结果与讨论

第四节 本章小结

参考文献

第四章 负载双重生长因子的SCTS水凝胶制备及其作为肝组织工程支架材料的可行性分析

第一节 引言

第二节 实验部分

第三节 结果与讨论

第四节 本章小结

参考文献

第五章 共混肽修饰的海藻酸盐材料诱导血管新生的研究

第一节 引言

第二节 实验部分

第三节 结果与讨论

第四节 本章小结

参考文献

第六章 全文结论

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果