龙胆苦苷的微生物转化研究

摘要

龙胆苦苷(gentiopicroside)是龙胆科植物的苦味成分,主要来源于秦艽和龙胆,具有显著的抗炎、抗乙肝病毒、保肝、利胆、镇痛及清除自由基等作用。本文报道了17种真菌对龙胆苦苷的生物转化,考察了乙醇超声提取阿坝产麻花秦艽的最佳工艺,并测定了云南栽培秦艽中龙胆苦苷的含量。主要研究内容如下:
　　 1、采用生长细胞转化法,从17株真菌中筛选出16株能转化龙胆苦苷的菌种,包括:绿色木霉(Trichoderma viride)、黑根霉(Rhisopus nigricans)、黑曲霉(Asperillus,niger),米曲霉(Asperillus oryzae)、桔青霉(Penicillium citrinum)、辣椒炭疽菌(Gloeosprium piperatum)、苹果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花红腐病菌(Fusarium moniliforme)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、葡萄黑痘病菌(Sphaceloma ampelium)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、坪草腐霉枯萎病菌(Pythium aphanidermatum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)以及乳酒假丝酵母(Candida kefyr)。其中,绿色木霉具有最好的转化能力。高效液相色谱(HPLC)检测到两个转化产物,但在薄层色谱(TLC)上只能显示其中一个主产物。
　　 2、采用结晶法分离纯化出一个转化产物,通过光谱学方法(紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振氢询鉴定了该转化产物的结构,其分子式为C10H12O4,化学名称为5,6-dihydro-5-hydroxymethyl-6-methyl-1H,3H-pyrano[3,4-c]pyran-1-one。
　　 3、采用单因素实验和正交试验对绿色木霉转化龙胆苦苷的最佳转化条件进行了优化。研究了培养基初始pH、底物浓度、接种量、转速、转化温度、转化时间等6个单因素对龙胆苦苷转化产物的影响,实验结果表明对龙胆苦苷转化影响较大的单因素有:底物浓度、接种量、转化温度和转化时间。正交试验优化转化条件,得到龙胆苦苷的最佳转化工艺为:底物浓度0.4mg/mL、接种量2.5％、转化时间6d和转化温度25℃。四个因素对转化产物的影响大小依次为转化温度>接种量>底物浓度>转化时间。
　　 4、正交试验法优选了乙醇超声提取阿坝产麻花秦艽中龙胆苦苷的提取工艺,最佳工艺为提取次数4次、乙醇浓度95％、提取时间20min和提取温度50℃,验证试验测得龙胆苦苷提取含量达9.32％。四个因素对龙胆苦苷提取的影响次序为提取时间>乙醇浓度>提取温度>提取次数。检测了云南栽培秦艽中龙胆苦苷的含量为5.05％,高于药典对秦艽提取物中龙胆苦苷含量不得低于2％的规定。