慈竹木质素合成酶基因CCoAOMT、COMT和CAD的克隆、生物信息学分析与组织表达分析

摘要

竹浆造纸中竹木质素的脱除，不但污染环境，而且提高了造纸成本，因此，用基因工程手段培育新型竹材已成为当今国内外的研究热点。目前，在已知竹浆用竹种中，只从绿竹和毛竹中克隆得到木质素合成酶基因CCoAOMT、COMT和CAD，而慈竹中未见报道。为此，本研究以纤维质量好的慈竹为研究材料，采用RACE技术克隆和同源克隆CCoAOMT、COMT和CAD基因，并对其进行生物信息学和组织表达分析，为CCoAOMT、COMT和CAD基因在大型丛生竹遗传改良中的应用提供理论依据。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.采用Race技术克隆并获得了一个慈竹木质素合成酶CCoAOMT基因全长序列(GenBank注册号为JF742462)，命名为NaCCoAOMT1；COMT基因全长序列(GenBank登录号为JN837484)，命名为NaCOMT；CAD基因的保守区及其3'RACE cDNA。
　　 2.生物信息学分析结果表明，慈竹CCoAOM7基因cDNA全长序列，全长为1051bp，含有一个777bp的读码框，编码一个包含258个氨基酸的蛋白质，分子量约为28.861kD，等电点为5.33，二级结构中α-螺旋占42.25％，β-转角占8.91％，延伸链占15.89％、无规卷曲占32.95％。氨基酸多序列比对结果表明，慈竹与绿竹的CCoAOMT1基因亲缘关系最近，但慈竹CCoAOMT基因编码的氨基酸与绿竹相比，在第十位点上发生了缺失，5个位点发生了变异。慈竹、绿竹、毛竹、玉米CCoAOMT基因编码的氨基酸中都含有1个相对保守的无序化区域。
　　 慈竹COMT基因cDNA全长序列为1378bp，其编码一个包含360氨基酸的蛋白，分子量约为38.9741kD，理论等电点为5.38。预测其氨基酸序列包含29个酸性残基(Asp+Glu)，41个碱性残基(Arg+Lys)，总亲水性平均系数0.079。其中176个氨基酸可能形成α-螺旋，32个氨基酸可能形成β-转角，49个氨基酸可能形成延伸链，103个氨基酸可能形成无规卷曲。多序列比对结果发现：慈竹与绿竹COMT基因编码的氨基酸同源率最高，仅11个位点发生了变异。FoldIndex分析结果发现：所选物种中，只有甘蔗COMT基因编码蛋白质含有1个无序化相对保守区域，即CQMED，其余的都不具有无序化特性。
　　 3.NaCCoAOMT1和NaCOMT基因的RT-PCR分析结果表明，NaCCoAOMT1基因的表达主要在较幼嫩的组织。NaCOMT基因在未展开叶、展开叶、笋的中部和茎的中部表达量较高。
　　 4.构建了NaCCoAOMT1基因RNA干扰表达载体。