2株黄龙嗜冷细菌胞外产物对碳酸钙矿化的影响

摘要

黄龙以其独特的沉积地貌和绚烂的钙华景观于1992年被联合国教科文组织列为世界自然遗产，是世界著名的钙华景观之一。目前认为黄龙钙华主要由物理及水化学作用产生，而生物因素在钙华形成过程中也起到了一定的作用。前期研究发现，黄龙水体中的细菌数量极为可观，仅可培养细菌就达到106cfu/mL，因而这些细菌必然会或多或少地参与到钙华的沉积过程中。本课题以分离自黄龙水体中的典型嗜冷菌株为实验菌株，采用高效液相色谱在培养条件下对菌株胞外产物（有机酸、氨基酸及多糖）等有机组分进行了表征，对嗜冷细菌代谢特征进行了初步的分析;通过模拟黄龙低温沉积环境，利用ICP、XRD、SEM、FT-IR等分析测试手段，考察了供试菌株特征组分、细胞体、胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)等有机因素对碳酸钙沉积过程及沉积产物的影响及调控作用，并初步分析了沉积物形成的可能机制，其研究结果对明确黄龙钙华的生物成因及对提出防止钙华退化的保护及治理措施具有重要意义。主要结果如下:
　　(1)16s rDNA序列测定结果表明供试菌株20-18和21-3为假单胞属细菌（Pseudomonas）。采用高效液相色谱对供试菌株胞外有机酸、氨基酸及胞外多糖水解液中单糖的成分进行测定。结果表明:有机酸组分主要包括乳酸、柠檬酸和琥珀酸;氨基酸组分包括组氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸;多糖水解液中主要组分包括葡萄糖和核糖。
　　(2)考察了2种有机酸组分对钙化体系中钙化动力学过程及碳酸钙晶型和形貌的影响。结果表明:有机酸一定程度地抑制了碳酸钙的沉积;柠檬酸主要调控合成了长轴粒径约5-10μm、短轴粒径为3-5μm的棒状方解石型碳酸钙;琥珀酸（160mg·L-1）可以诱导球霰石型碳酸钙的合成。
　　(3)考察了3种氨基酸组分对钙化体系中钙化动力学过程及碳酸钙晶型和形貌的影响。结果表明:L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-半胱氨酸均可促进碳酸钙的沉积;L-酪氨酸和L-苯丙氨酸诱导合成了菱面体发育不完善的方解石;L-半胱氨酸调控合成了少量长轴约10-15μm的簇状文石。
　　(4)考察了2种单糖组分对钙化体系中钙化动力学过程及碳酸钙晶型和形貌的影响。结果表明:葡萄糖和核糖一定程度上促进了碳酸钙的沉积;高浓度葡萄糖(80、160mg·L-1)可诱导合成梭状、簇状形貌的文石型碳酸钙。
　　(5)考察了有机酸-氨基酸-单糖交互作用对钙化体系中钙化动力学过程及碳酸钙晶型和形貌的影响。结果表明:氨基酸-单糖体系一定程度上促进了碳酸钙的沉积，而有机酸交互体系一定程度上抑制了碳酸钙的沉积;氨基酸-单糖体系合成了少量蛋糕状结构球霰石晶体，这些蛋糕状结构可能由环状晶片层层堆叠而成。
　　(6)考察了供试菌株细胞体、EPS及细胞分泌液对钙化体系中钙化动力学过程及碳酸钙晶型和形貌的影响。结果表明:EPS溶液及菌体细胞对钙华沉积具有微弱的促进作用，而去EPS细胞和细胞分泌液一定程度上抑制了碳酸钙的沉积;菌株20-18菌体细胞调控合成了晶片交错排列的球状体结构;菌株21-3的EPS溶液诱导合成了环状晶体(5-10μm)和立方晶体(5-20μm)的嵌合体。这些超晶格结构的合成可能同细胞表面的带电基团的吸附稳定效应及EPS中两亲分子的定向排列组装有关。
　　综上，黄龙嗜冷细菌胞外特征组分、细胞体、EPS对碳酸钙沉积过程及沉积物的晶型和形貌具有多样的调控影响，这些有机组分对碳酸钙沉积的促进或抑制作用对黄龙钙华退化因素地揭示以及保护措施地提出具有重要意义。同时初步解释了有机组分介导下，碳酸钙晶型和形貌可能的形成机制，一定程度上揭示了微生物在黄龙钙华形成过程中作用机理。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 黄龙景区概况

1．2 黄龙钙华成因研究现状

1．2．1 热成因论

1．2．2 冷成因论

1．2．3 生物成因

1．3 微生物碳酸盐岩

1．3．1 微生物碳酸盐岩沉积机制

1．3．2 微生物席中的生物矿化作用

1．4 生物矿化过程及生长机理

1．4．1 生物矿化概念

1．4．2 生长机制

1．5 碳酸钙的仿生矿化

1．5．1 仿生矿化

1．5．2 碳酸钙晶型

1．5．3 碳酸钙调控的研究进展

1．6 论文选题意义及主要内容

1．6．1 选题意义

1．6．2 研究内容

2 假单胞菌株的鉴定及胞外产物的表征

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 菌株筛选

2．1．3 16s rDNA分子鉴定

2．1．4 溶液的配制

2．1．5 生长曲线的绘制

2．1．6 胞外有机酸待测液的制备

2．1．7 胞外氨基酸待测液的制备

2．1．8 氨基酸溶液的衍生

2．1．9 胞外单糖待测液的制备

2．1．10 有机组分标准曲线的绘制

2．1．11 色谱条件

2．2 结果与分析

2．2．1 供试菌株的筛选

2．2．2 系统发育分析

2．2．3 生长曲线的测定

2．2．4 胞外有机酸的表征

2．2．5 胞外氨基酸的表征

2．2．6 胞外多糖中单糖组分的表征

2．3 本章小结

3 有机酸对碳酸钙矿化的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 溶剂配制

3．1．3 钙化体系

3．1．4 有机酸浓度

3．1．5 初始pH

3．1．6 温度

3．1．7 钙离子浓度测定及钙化速率的表征

3．1．8 晶型的表征

3．1．9 形貌的表征

3．2 结果与分析

3．2．1 柠檬酸对CaCO3钙化体系的影响

3．2．2 琥珀酸对CaCO3钙化体系的影响

3．3 讨论

3．3．1 浓度对钙化体系的影响

3．3．2 pH对钙化体系的影响

3．3．3 温度对钙化体系的影响

3．4 本章小结

4 氨基酸对碳酸钙矿化的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 溶剂配制

4．1．3 钙化体系

4．1．4 钙离子浓度测定、晶型的表征及形貌的表征

4．2 结果与分析

4．2．1 L-酪氨酸对CaCO3钙化体系的影响

4．2．2 L-苯丙氨酸对CaCO3钙化体系的影响

4．2．3 L-半胱氨酸对CaCO3钙化体系的影响

4．3 讨论

4．3．1 L-酪氨酸对钙化体系的影响

4．3．2 L-苯丙氨酸对钙化体系的影响

4．3．3 L-半胱氨酸对钙化体系的影响

4．4 本章小结

5 单糖对碳酸钙矿化的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 溶剂配置

5．1．3 钙化体系

5．1．4 钙离子浓度测定、晶型的表征及形貌的表征

5．2 结果与分析

5．2．1 D-葡萄糖对CaCO3钙化体系的影响

5．2．2 D-核糖对CaCO3钙化体系的影响

5．3 讨论

5．3．1 D-葡萄糖对钙化体系的影响

5．3．2 D-核糖对钙化体系的影响

5．4 本章小结

6 有机酸、氨基酸和单糖交互作用对碳酸钙矿化的影响

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 溶剂配制

6．1．3 钙化体系

6．1．4 钙离子浓度测定、晶型和形貌的表征

6．2 结果与分析

6．2．1 各交互处理组对钙化体系中动力学过程的影响

6．2．2 各交互处理组对CaCO3晶型的影响

6．2．3 各交互处理组对CaCO3形貌的影响

6．3 讨论

6．3．1 各交互处理组对钙化体系中动力学过程的影响

6．3．2 各交互处理组对CaCO3晶型和形貌的影响

6．4 本章小结

7 供试菌株胞外聚合物(EPS)对碳酸钙矿化的影响

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7．1．2 细菌的培养

7．1．3 胞外分泌液的收集

7．1．4 EPS的提取

7．1．5 钙化体系

7．1．6 钙离子浓度测定、晶型和形貌的表征

7．2 结果与分析

7．2．1 菌株20-18对CaCO3钙化体系的影响

7．2．2 菌株21-3对CaCO3钙化体系的影响

7．3 讨论

7．3．1 菌株20-18对钙化体系的影响

7．3．2 菌株21-3对钙化体系的影响

7．4 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果