胡杨中液泡膜水通道蛋白PeTIP1；2基因功能及其启动子研究

摘要

水通道蛋白(aquaproin,AQP)是一类高度保守的蛋白质，具有一定的选择性和较高的水分渗透性，其相对分子质量一般在23-31 Ku之间，属于膜内在蛋白(major instrinsic protein,MIPs)超家族，广泛存在于植物、动物、微生物等各类生物体中，目前在这些生物体内已经发现了150多种MIP。对植物体内水分运输、小分子溶质、气体和重金属的运输、根的水分吸收、细胞的伸长与分化、植物生殖生长等多种生理过程均有重要的调节作用。在逆境胁迫的条件下，植物水通道蛋白也能对非生物胁迫作出应答，包括盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫和重金属胁迫等非生物胁迫。本实验是以胡杨、毛白杨和烟草为材料，对胡杨AQP蛋白基因PeTIP1;2进行克隆，并对PeTIP1;2基因的转基因植物在重金属胁迫、盐胁迫和干旱胁迫等条件下的调控作用进行研究，同时对35Spro::PeTIP1;2-RNAi载体构建和基因敲除进行探究，然后也通过拟南芥原生质体对PeTIP1;2蛋白进行亚细胞定位，最后还研究克隆了PeTIP1;2启动子，构建PeTIP1;2pro::GUS植物表达载体转化杨树；分析启动子的组织表达和在盐和甘露醇诱导下的组织表达差异。从功能分析和表达调控研究两方面初步研究了该基因在胡杨抗逆性机制中的作用。取得的研究成果如下： 1.PeTIP1;2基因克隆和转基因植物鉴定 本研究通过克隆胡杨PeTIP1;2基因，采用叶盘转化法转化毛白杨和烟草，共得到组培杨树18棵，其中阳性杨树16棵，阳性率88.88%，通过实时荧光定量PCR分析表达量最高的是野生型毛白杨的59.7倍，最低为0.20倍；得到组培烟草24株，其中阳性烟草23株，阳性率为95.8%。 2.胡杨PeTIP1;2基因功能 本研究对异源过表达胡杨PeTIP1;2基因的转基因烟草进行不同的非生物胁迫处理，发现转基因烟草在含有200 mmol/L NaCl的1/2MS培养基上的根长显著高于野生型烟草，对烟草进行土培实验，发现转基因烟草和野生型烟草都能在正常浇水下正常生长，当浇入200 mmol/L NaCl溶液时野生型和转基因烟草叶片开始变黄，但是野生型表型更明显且叶片出现萎蔫，说明异源过表达PeTIP1;2基因提高了烟草对盐的抗性；转基因烟草在含有300 mmol/L Mannitol(甘露醇)的1/2MS培养基上的根长显著长于野生型烟草，对烟草自然干旱处理7d后发现野生型烟草变萎蔫，转基因烟草长势良好，说明异源过表达PeTIP1;2基因可以提高烟草对干旱的抗性；对转基因烟草和野生型烟草用含有50 mmol/L CuSO4·5H2O处理，发现野生型烟草明显萎蔫且受到严重伤害而转基因烟草受到伤害较小且没有出现明显的萎蔫，说明异源过表达PeTIP1;2基因提高了烟草对重金属硫酸铜胁迫的抗性。 本研究采用拟南芥原生质体进行亚细胞定位，结果显示PeTIP1;2蛋白定位主要在液泡膜上。基于胡杨基因组数据，克隆PeTIP1;2的启动子构建PeTIP1;2pro::GUS植物表达载体转化毛白杨；分析启动子的组织表达和200 mmol/L NaCl和300 mmol/L Mannitol诱导下的组织表达差异。初步表明PeTIP1;2基因为诱导表达性，主要在叶中表达，少部分在根中表达，茎中基本不表达。 3.RNAi干扰实验 本研究通过构建35Spro::PeTIP1;2-RNAi载体，采用叶盘法转化毛白杨中获得RNAi干扰阳性杨树共9棵。

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摘 要

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第一章 绪论

1.1 水通道白

1.1.1 水通道蛋白的发现

1.1.2 水通道蛋白的家族成员

1.1.3 水通道蛋白的结构

1.1.4 水通道蛋白的功能

1.2 RNA干扰（RNA interference, RNAi）简介

1.3本研究的目的与意义

1.4主要研究内容和技术路线

1.4.1 主要的研究内容

1.4.2 实验技术路线图

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验质粒和菌株

2.3 实验试剂

2.4 实验方法

2.4.1 生物信息学分析

2.4.2 总DNA的提取和纯化

2.4.3 总RNA的提取

2.4.4 DNA的合成

2.4.5 基因扩增

2.4.6 PCR扩增产物胶回收纯化

2.4.7 感受态细胞制备过程

2.4.8 T载体构建与转化

2.4.9 菌液PCR阳性验证及质粒提取

2.4.10 酶切验证和测序

2.4.11 重组质粒的构建

2.4.12 重组质粒转化农杆菌

2.4.13 农杆菌介导的遗传转化和植株阳性验证

2.4.14 GUS染色实验

2.4.15 亚细胞定位实验

2.4.16 烟草实验方法

2.4.17数据处理与分析

第三章 实验结果与分析

3.1 生物信息学分析

3.2胡杨PeTIP1;2基因的组织表达分析

3.3 过表达载体构建和转基因植株鉴定

3.3.1目的基因PeTIP1;2 基因的克隆

3.3.2 转基因杨树阳性鉴定

3.3.3 转基因烟草过表达植物鉴定

3.4 转基因烟草对不同逆境的响应

3.4.1 转基因烟草在Mannitol（甘露醇）胁迫下的生长情况

3.4.2 转基因烟草在NaCl胁迫下的生长情况

3.4.3 转基因烟草在CuSO4·5H2O胁迫下的生长情况

3.5 RNAi表达载体构建和转基因植株鉴定

3.5.2转基因植株鉴定

3.6 胡杨PeTIP1;2基因亚细胞定位分析

3.6.1 引物设计与载体构建

3.6.2胡杨PeTIP1;2亚细胞定位结果

3.6.3 PeTIP1;2基因启动子的克隆及组织定位

3.6.4转基因毛白杨处理后GUS结果分析

第四章 讨论及展望

4.1 结论

4.2 讨论

4.3 展望

致　　谢

参考文献

附　　录

攻读学位期间发表的与学术论文相关论文