水通道蛋白基因功能研究——AQP1在肿瘤血管生成中的作用及EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立

摘要

本论文另一部分工作是建立表达对氯离子敏感的绿色荧光蛋白突变体EYFP-V163S的转基因小鼠模型.目的是用于水和氯离子跨膜转运的体内研究.到目前为止,由于缺乏体内研究手段,人们对水和氯离子跨膜和跨细胞转运的研究主要是通过对体外培养的细胞研究来实现的;对水通道和氯离子通道的理论知识也主要是基于对体外细胞研究,缺乏在体组织细胞膜水分子和氯离子通透性的直接研究.为了更深入地研究水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况,完善水通道和氯离子通道的理论知识,同时实现体内各组织细胞对水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况的系统研究,急需发展体内研究手段.随着生命科学从基因研究到功能研究的转变,发展体内研究手段更显重要.所以,建立对氯离子浓度极为敏感的EYFP-V163S的转基因小鼠模型,实现对水和氯离子跨膜转运的体内研究具有重要的意义.建立全身性高表达EYFP-V163S的转基因小鼠模型,利用该动物模型,通过器官组织体内原位灌注和动态荧光记录,可以实现对各种组织细胞膜的水和氯离子通透性直接测定.同时也可将各种表达EYFP-V163S的组织细胞进行体外培养建系,将之作为水通道或氯离子通道调节剂筛选和功能测定模型.本研究以氯离子敏感且特异性很强的EYFP-V163S作为目的基因,采用基因敲入技术,将EYFP-V163S基因定点整合到小鼠E14胚胎干细胞基因组的管家基因ROSA26位点中,借助该基因的强启动子表达EYFP-V163S.利用双筛选策略构建打靶载体,大大地提高了打靶效率,使其阳性率达到60﹪.建立稳定表达EYFP-V163S的E14胚胎干细胞株并通过显微注射,将其导入到囊胚腔,目前已获得两只嵌合体鼠,但是转基因传代未能成功.PCR检测结果显示,EYFP-V163S主要分布在大脑、骨骼肌、心脏、肾脏及肺血管中,睾丸则为阴性,进一步的免疫组化也证实EYFP-V163S主要在上述的五种器官或组织中表达,在大脑中表达最强,肾小管中表达最弱,睾丸为阴性.这说明ES细胞未能进入嵌合体鼠的生殖系统,本研究正在用不同的EYFP-V163S干细胞克隆进行囊胚注射,以期最终获得生殖细胞转染的EYFP-V163S转基因鼠.

目录

文摘

英文文摘

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第一章AQP1在肿瘤血管生成中的作用研究

第一部分引言

一、水通道蛋白的发现、命名及分类

二、水通道蛋白的组织分布、表达及调控

三、水通道蛋白的分子结构

四、水通道蛋白的生理和病理学意义

五、水通道蛋白未来基础研究和临床应用前景

六、AQP1与肿瘤血管生成的关系

七、本研究的目的与意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第三部分实验结果

一、B16F10细胞培养及其活力测定结果

二、AQP1(-/-)小鼠和AQP1(+/+)小鼠黑色素瘤瘤体大小测定结果

三、AQP1抗体免疫染色黑色素瘤的结果

四、CD31抗体免疫染色黑色素瘤及肿瘤血管密度测定结果

第四部分讨论

一、AQP1敲除抑制肿瘤新生血管生成的机制

二、AQP1抑制剂可能成为抑制肿瘤血管生成的新型抗肿瘤药物

第五部分结 论

第二章EYFP-V163S小鼠转基因模型的建立

第一部分引言

一、绿色荧光蛋白及其突变体的分子特性

二、动物转基因与基因打靶

三、ROSA26基因位点的特性及其在动物转基因中的应用

四、本研究的目的及意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第三部分实验结果

一、ROSA26Targeting-EYFP-V163S打靶载体的构建策略

二、ES细胞筛选鉴定结果

三、转基因小鼠的鉴定

第四部分讨论

一、EYFP-V163S转基因鼠模型的意义及应用

二、本研究得到的启示

第五部分结 论

参考文献

主要英文缩写词表

致谢

攻读博士学位期间已发表的论文