图案化纤维膜支架上血管相关细胞共培养的研究

摘要

成熟血管主要由形成内腔的内皮细胞层和平滑肌细胞层组成，其中平滑肌细胞层中细胞定向排列，以提供力学强度和调控血管壁厚度。为模拟血管的组成和结构，本论文利用静电纺丝技术和光刻蚀技术制备具有脊沟结构的图案化纤维膜。图案化纤维膜用于种植血管平滑肌细胞(SMC)，平板纤维膜用于种植血管内皮细胞(EC)，实施共培养。研究结果表明，SMC在图案化纤维膜上培养后，细胞生长和细胞外基质分泌主要汇集于图案化纤维膜的脊区域，并具有一定的排列走向，同时SMC迁移渗透进入图案化纤维膜内部。相对于内皮细胞和平滑肌细胞在纤维上的单独培养，共培养促进了EC和SMC的增殖、EC分泌层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)、SMC分泌α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ);相对于EC，共培养对SMC增殖和细胞外基质分泌的促进作用更为明显。
　　 培养功能化血管组织须在体系中提供充分的生化信号分子，其中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是促进EC和SMC黏附生长的重要因素之一。据此，本论文利用编码VEGF和bFGF的质粒与磷酸钙(CaP)形成复合纳米粒子，构建携载CaP/pDNA复合粒子的图案化纤维膜与平板纤维膜，实施EC和SMC的共培养。结果表明在纤维上共培养EC和SMC，载CaP/pDNA复合粒子的引入促进了EC和SMC的增殖、EC胞外基质LN和Col-Ⅳ的分泌、SMC胞外基质α-SMA和Col-Ⅰ的分泌;在图案化纤维上SMC显示出较好的取向性，载CaP/pDNA复合粒子的引入促进了SMC在纤维支架中的渗透，显示出共培养体系下图案化因素和生化因子相结合对细胞行为的影响更为显著。
　　 通过将人脐带EC和SMC分别接种到纤维膜上，构建了体外血管培养装置。结果表明血管培养2个月后内皮细胞在支架内层形成连续的血管内腔，平滑肌细胞渗透进入纤维支架内部，内皮层和平滑肌层紧密连接;同时平滑肌细胞及分泌胞外基质呈定向排列，较好地模拟了血管的结构。力学性能测试表明培养2个月后血管的径向顺应性为0.56％/100mmHg、爆破强度为650mmHg，离正常血管还有一定的差距，有待进一步提高体外构建血管的生物力学性能。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 血管组织工程

1．1．1 血管组织工程支架

1．1．2 携载活性物质的血管组织工程支架

1．2 静电纺聚合物纤维膜

1．2．1 静电纺纤维在组织工程中的应用

1．2．2 静电纺纤维结构和形貌的调控

1．3 图案化组织工程支架

1．3．1 图案化组织工程支架的特点

1．3．2 图案化组织工程支架的制备方法

1．4 细胞共培养

1．4．1 细胞共培养的方法

1．4．2 图案化支架上细胞的共培养

1．5 磷酸钙纳米粒子作为基因载体

1．5．1 磷酸钙纳米粒子作为基因载体的特点

1．5．2 载DNA磷酸钙纳米粒子的研究进展

1．6 课题的立题意义和研究内容

1．6．1 课题的来源

1．6．2 本课题的研究目的和意义

1．6．3 本课题的研究内容

1．6．4 本课题的创新点

第2章 图案化纤维膜上细胞的共培养

2．1 实验部分

2．1．1 实验材料

2．1．2 图案化接收板的设计和制作

2．1．3 图案化纤维膜的制备

2．1．4 图案化纤维膜的表征

2．1．5 细胞培养

2．1．6 细胞在纤维膜的培养

2．1．7 细胞在图案化纤维膜上的粘附及增殖

2．1．8 细胞在图案化纤维膜上的分布

2．1．9 细胞共培养体系中细胞外基质的分泌

2．1．10 细胞共培养体系中细胞的骨架

2．1．11 统计学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 图案纤维膜的形貌及纤维排列特点

2．2．2 图案化纤维的叠加

2．2．2 细胞在图案化纤维膜上的分布

2．2．3 细胞在纤维膜上增殖

2．2．4 细胞在纤维膜上细胞外基质的分泌

2．2．5 细胞在纤维支架中的渗透

2．2．6 纤维上细胞骨架的排列

2．3 本章小结

第3章 载CaP／pDNA粒子图案化纤维膜上细胞的共培养

3．1 实验部分

3．1．1 实验材料

3．1．2 CaP／pDNA复合纳米粒子的制备及表征

3．1．3 载CaP／pDNA复合纳米粒子图案化纤维膜的制备

3．1．4 细胞在电纺纤维膜上的接种

3．1．5 细胞在携载复合粒子图案化纤维膜上共培养时的生长行为

3．1．6 载pDNA纤维膜上细胞共培养的细胞外基质分泌

3．1．7 载pDNA纤维膜上细胞共培养的细胞骨架

3．1．8 统计学分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 CaP／pDNA复合纳米粒子的表征

．2．2 载CaP／pDNA复合纳米粒子图案化纤维膜的表征

3．2．3 细胞生长行为的表征

3．2．4 细胞在在纤维膜中的渗透

3．2．5 细胞在纤维膜上细胞外基质的分泌

3．2．7 细胞在纤维膜上的细胞骨架

3．3 本章小结

第4章 图案化纤维支架体外构建血管的初步研究

4．1 实验部分

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验装置的制备

4．1．3 人工血管的体外培养

4．1．4 组织学观察

4．1．5 生物力学性能检测

4．2 结果与讨论

4．2．1 体外培养人工血管的过程

4．2．2 细胞在纤维支架上的分布

4．2．3 血管的生物力学性能

4．3 本章小结

全文结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文