软骨细胞和成骨细胞复合在藻酸钙/RGD支架上共培养的实验研究

摘要

目的：本实验的目的是在体外探索RGD对软骨细胞的生物学特性的影响、种子细胞与生物材料贴附后的生物学特性变化和利用两种细胞在体外混合共培的微环境对其生物学特性的影响，力求寻找RGD对细胞的最佳生物学效应、细胞与生物材料之间的最佳整合、最佳仿生体内的微环境和探索不同细胞间的相互影响。 方法：本研究分为4部分： 1．采用酶消化法可以获得大量纯度高的软骨细胞，利用甲苯胺蓝和番红O对其鉴定。 2．软骨细胞在不同浓度RGD的刺激作用下的平面培养：动态检测培养P2软骨细胞的增殖率和细胞外基质的含量；动态观察P2软骨细胞在不同浓度RGD的刺激下细胞的贴壁率和生长、增值及分化情况；采用MTT比色法对细胞的活性进行检测。 3．采用翻转干沽法来获得纯度高的成骨细胞，利用碱性磷酸酶对其进行鉴定。 4．软骨细胞与成骨细胞以不同比例（1：2，1：1，2：1）混合在一起在不同浓度RGD刺激下的单层培养和在不同浓度RGD与藻酸盐共价交联的支架上复合共培养，在2、4、6周动态检测混合培养的的软骨细胞与成骨细胞在单层和藻酸盐/RGD环境下的生物学特性的变化的规律，采用消化计数法对比在藻酸盐上共孵细胞增殖率和采用组织学及组织免疫学对比两种细胞混合在一起在不同时间的生物学特征。 结果： 1、采用酶过夜和非过夜消化法可以获取纯度高、活性高的的软骨细胞。 2、平面单层培养的二代软骨细胞在不同浓度RGD的刺激下呈现具有不同的差异性，不同浓度组对软骨细胞的生物学特性的影响则表现不同．无药组、1ug/ml、2ug/ml组的软骨细胞的贴壁率无明显差异、对生长和细胞活性未见明显影响，4ug/ml和8ug/ml组明显增加软骨细胞的贴壁率，4ug/ml组表现对软骨细胞增殖和活性无抑制作用，维持细胞的良好表型，但8ug/ml组对软骨细胞增殖及活性具有抑制作用，并出细胞死亡的现象，细胞增殖和活性低于其他组。 3、采用组织块翻转干沽法来获得细胞80％以上均是成骨细胞，纯度高。 4、a、在rAC和rAO混合爬片培养时，以2：1组混合培养时两种细胞生长、增殖相当，而1：2、1：1组中软骨细胞表现生长缓慢、稀少，随着时间的增加甚至难以发现，而成骨细胞数目占据绝对优势，生长、分泌活跃。b、藻酸钠包裹的rAC和rAO混合培养组中，与藻酸盐交联的RGD4ug/ml组的两种细胞生物学特性表现良好。4ug/ml组明显高于阴性对照组和2ug/ml组，且较稳定，支架材料未见明显的降解，两种细胞表型均具有较强的表达。而8ug/ml时使细胞粘附增殖快，但生物材料在2周时开始出现崩裂、塌陷，导致后期细胞生长不佳，甚至发生死亡。阴性对照组与2ug/ml组无明显差异。组织学表现：在爬片组中，Ⅱ型胶原和糖胺多糖的强度随软骨细胞的比例增加而增强，碱性磷酸酶表达强度随其增加而减弱，2-4周逐渐增加，4-6周逐渐降低；同一比例组中阴性对照组与2ug/ml组Ⅱ型胶原和糖胺多糖表达的强度弱于4ugml组，8ug/ml组明显比无药组和2ug/ml组弱，阴性对照组和2ug/ml组之间无明显的差异。在支架上培养时，在0——4ug/ml组中Ⅱ型胶原表达的强度呈峰值变化，糖胺多糖与碱性磷酸酶的表达强度在2-4周逐渐增加，4-6周稳定；4ug/ml组表达最强，阴性对照组和2ug/ml组之间差异不明显；8ug/ml组的时间变化而逐渐减弱，在2周时高于阴性对照组和2ug/ml组，在4、6周时其强度时明显地弱于其他组。 结论： 1、酶消化法是获取软骨细胞的一种可行性方法。 2、通过对单一软骨细胞单层培养的研究，少量的RGD对软骨细胞的贴壁、增殖分化无明显促进作用，而高浓度的刺激虽可促进贴壁，但抑制其生长、增殖、分化，适合的浓度能促进软骨细胞贴壁而对生长无明显的抑制作用。 3、翻转干沽法是获取成骨细胞可行性的方法。 4、经过软骨细胞和成骨细胞混合组在爬片培养和藻酸盐三维支架上培养的研究，得出适合的比例有利于两种细胞均匀的增殖、分化，具有成软骨和成骨效应；高浓度的RGD（8ug/ml）能使藻酸盐生物材料加速降解，适合的浓度（4ug/ml）能促进细胞贴壁、增殖。rAC和rAO混合培养为下一步构建软骨-骨样组织或生长板样结构提供一定的参考线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词

声明

前言

第一部分关节软骨细胞获取、培养、传代及鉴定

前言

材料与方法

附图

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 RGD对二代软骨细胞贴壁、增殖、活性的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 成骨细胞的获取、培养、传代及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 软骨细胞与成骨细胞共培养的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述软骨细胞和成骨细胞复合藻酸钙/RGD支架研究进展

致 谢