贻贝仿生磷酸钙骨水泥的性能及其体内植入实验的研究

摘要

受海洋生物贻贝超强粘附性能的启发，本文拟将具有超强粘附性能的聚多巴胺(PDA)加入磷酸钙骨水泥(CPC)，利用其粘附性能提高CPC的抗压强度，并研究PDA对CPC体外矿化和植入体内后对成骨、与宿主骨的结合能力等方面的影响，探讨其可能存在的机理。
　　本文拟将多巴胺(DA)溶于Tris-HCl缓冲液中，于空气中氧化2d，使DA氧化自聚合生成PDA，并作为液相与CPC固相粉末混合后成型。以DA的浓度、液固比和pH值为三个因素，通过正交实验选出最优组合。采用万能力学试验机、吉摩尔针、X射线衍射仪(XRD)和傅立叶红外光谱仪(FTIR)表征优组合CPC的理化性能;用扫描电镜(SEM)观察断面的微观形貌;采用紫外可见光分光光度计研究优组合CPC的体外降解。正交实验和抗压强度结果表明优组合为DA浓度40 mg/mL、液固比0.3 mL/g和pH8.5组的CPC，优组合CPC抗压强度与空白CPC相比存在极显著性差异(p＜0.01);优组合CPC的凝固时间（包括初凝时间和终凝时间）与空白组相比无显著性差异，均符合临床要求;XRD和FTIR研究表明，PDA的加入促进了CPC中固相成分之一的二水磷酸氢钙(DCPD)的转化;SEM研究发现PDA使CPC内部形成了纳米级片状结构和较多结合紧密的块状晶体，且与空白CPC相比断面孔隙明显减少;优组合CPC体外降解过程中，未聚合的DA的累积释放量为加入总量的29.7％，且浸泡液的pH处于人体安全范围内。
　　将上述优水平CPC（标记为PDA-CPC）浸泡在模拟体液(SBF)内，分别采用XRD、FTIR和XPS表征浸泡后的PDA-CPC表面的物相、表面官能团和表面元素;SEM和TEM(包括选区电子衍射、能量色散光谱和高分辨TEM)分别表征PDA-CPC的表面形貌和原子结构中的成分信息，不含PDA的CPC作为空白对照（标记为control-CPC）。XRD结果表明DCPD和CaCO3的衍射峰分别在浸泡1和3d后消失，PDA在浸泡前和浸泡1、3和7d时促进了DCPD和α-TCP向HA转化，但后期（10和14d）起到抑制转化的作用。FTIR结果表明，PDA-CPC表面磷酸根的v3振动峰相对control-CPC发生了红移，类似自然骨中的HA的v3振动峰，说明PDA改变了HA中磷酸根的化学环境。SEM结果表明，浸泡1d后PDA-CPC表面出现明显的矿化层，而control-CPC浸泡7d后才出现矿化层，表明PDA可提高CPC的早期矿化能力。矿化层由类骨形状的纳米级磷酸钙(CaP)组成，并且整个浸泡过程中一直呈纳米级CaP，而control-CPC则表现为大尺寸的片状结构CaP。XPS结果表明浸泡14 d后在PDA-CPC表面出现了PDA的C=O，说明浸泡过程中PDA与新形成的CaP共沉淀。TEM结果表明，在PDA-CPC表面生成的纳米CaP为HA。
　　将PDA-CPC分别植入新西兰大白兔的颅骨、股骨和背部肌肉，取2、4和8 w三个时间点。通过植入3d后血液检测研究PDA对机体的炎症反应;X光观察PDA-CPC植入后的位置及降解情况;采用Push-out实验研究PDA-CPC与宿主骨的结合强度;XRD检测植入后材料的物相的转变过程;SEM观察植入后材料表明细胞的粘附情况和材料内部的形貌;通过激光共聚焦显微镜和组织学切片（硬组织切片和脱钙样品的切片）观察新骨的长入情况。3d血检结果表明PDA-CPC植入后血液中的炎症细胞的数量与control-CPC相比无明显的提高，说明其对机体无明显的毒性;X光结果表明颅骨和股骨植入位置正常，无明显的偏移，背部肌肉植入的PDA-CPC由于受到肌肉的收缩运动而稍有偏移;Push-out结果表明由于PDA的存在，提高了PDA-CPC与宿主骨的早期(2 w)结合强度;XRD结果表明PDA-CPC原始固相粉末中的DCPD和CaCO3于植入2 w后完全消失，并出现了HA的前驱相-磷酸八钙，随着植入时间的延长，HA的量逐渐增多;SEM表明植入2w后PDA-CPC表面和其与宿主骨结合的部位出现大量的细胞，材料内部出现与体外矿化结果类似的由纳米尺度线状CaP组成的微米球形;激光共聚焦显微镜结果表明PDA-CPC植入8 w后新骨生成的总量比control-CPC多;颅骨植入实验的硬组织切片表明PDA-CPC植入后可形成成熟度高的板层状骨，PDA-CPC植入背部肌肉的硬组织切片结果表明植入后样品周围组织无坏死，且大量的胶原纤维组织长入PDA-CPC内部，表明PDA-CPC具有良好的生物相容性。颅骨植入2w的石蜡切片结果显示PDA-CPC组中发现明显的骨髓腔、大量的红细胞、成骨细胞和破骨细胞，表明骨组织改建过程的进行。植入4w后骨的成熟度提高，PDA-CPC边部骨膜下有新骨生成，其机制符合膜内成骨机制。植入8w后PDA-CPC内长满组织，形貌比control-CPC完整，且PDA已降解。
　　本研究可为开发高强度、高活性和高骨修复能力的仿生CPC提供一条新的途径，并为其临床应用提供指导。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 磷酸钙骨水泥

1．1．1 CPC的组成和分类

1．1．2 CPC的性能

1．2 聚多巴胺

1．2．1 PDA的形成

1．2．2 PDA的应用

1．3 本课题的提出与研究内容

1．3．1 本课题的提出

1．3．2 本课题研究内容

第二章 聚多巴胺对磷酸钙骨水泥性能影响的研究

2．1 引言

2．2 实验材料和方法

2．2．1 CPC固相粉末的制备

2．2．2 正交实验设计

2．2．3 含PDA的CPC的制备

2．2．4 性能表征

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 正交实验结果分析

2．3．2 优水平凝固时间结果分析

2．3．3 优水平CPC水化24h的物相分析

2．3．4 优水平CPC水化24h的红外结果分析

2．3．5 优水平CPC断面形貌分析

2．3．6 优水平CPC体外降解结果分析

2．4 本章小结

第三章 聚多巴胺-磷酸钙骨水泥体外矿化的研究

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．2．1 CPC固相粉末的制备及SBF的配制

3．2．2 PDA-CPC和control-CPC的制备

3．2．3 PDA-CPC的仿生矿化

3．2．4 性能表征

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 PDA-CPC浸泡前后物相分析

3．3．2 PDA-CPC浸泡前后反射红外结果分析

3．3．3 PDA-CPC浸泡前后表面形貌分析

3．3．4 PDA-CPC浸泡14d后的表面元素分析

3．3．5 PDA-CPC浸泡14d后TEM分析

3．4 本章小结

第四章 动物实验

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 CPC的制备

4．2．2 植入实验前样品的处理

4．2．3 植入实验

4．2．4 动物实验评价

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 大体观察

4．3．2 X射线观察植入样品的位置及降解情况

4．3．3 PDA-CPC植入3d血液炎症细胞检测结果

4．3．4 PDA-CPC与宿主骨的结合强度测试结果

4．3．5 PDA-CPC表面细胞粘附及断面形貌观察

4．3．6 PDA-CPC植入后的物相分析

4．3．7 新骨形成的连续荧光标记结果

4．3．8 组织学观察

4．4 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文及科研成果