多重刺激响应型聚合物纳米颗粒在癌症治疗中的研究

摘要

纳米载体携载化疗药物用于抗肿瘤是目前肿瘤治疗研究中的热点。纳米载体用于肿瘤治疗有许多的优点，它不仅可以对水溶性较差的化疗药物起到很好的增溶效果，同时通过接枝靶向基团和具有刺激响应性化学键，能使抗肿瘤纳米载体实现药物靶向传递的同时也能使药物在肿瘤细胞内可控释放。传统的纳米载体往往只具有单一的刺激响应性或者单一的靶向效果，而体内真实的环境相对复杂，单一的刺激响应往往不能使纳米颗粒在进入肿瘤细胞后快速地响应细胞内或者外加的刺激，故无法实现药物快速释放。同时，随着抗肿瘤研究的深入，纳米靶向载体的研究也逐渐地从靶向细胞层面向细胞器层面深入。本论文旨在构建多靶向及多刺激响应的聚合物纳米载体，并考察其相关性能，体外释放药物以及体外和体内抗肿瘤效果。 本论文第二章，我们采用具有二硫键的单保护胱胺开环聚合己内酯，将二硫键髙效地引入到高分子聚合物中，避免了传统接枝响应基团接枝率不高的问题。之后通过缩合反应，成功合成了具有PBA靶向的PEG-SS-PCL，抗肿瘤药物DOX则通过酸不稳定腙键链接在两亲性高分子的疏水端。体外药物释放实验表明，胶束在双重刺激条件下，胶束结构的变化最终导致了药物的快速释放。通过激光共聚焦显微镜观察，具有靶向双响应的胶束能更多地被肿瘤细胞所内吞，进入细胞之后，在细胞内pH刺激和GSH刺激下，药物能快速地从胶束中释放。空白材料对正常细胞和肿瘤细胞都几乎无毒，而载药胶束中，具有靶向和双响应的PBA-PEG-SS-PCL-hyd-DOX胶束在靶向作用和双响应刺激下，具有最好的抗肿瘤效果。最后，通过荷H22肿瘤小鼠的体内抗肿瘤实验中，进一步的说明PBA-PEG-SS-PCL-hyd-DOX胶束能更好地靶向肿瘤组织，取得了最好的抗肿瘤效果。组织学层面，通过H&E染色和TUNEL染色，表明了空白材料对肿瘤细胞无杀害，而PBA-PEG-SS-PCL-hyd-DOX胶束则具有最好的抗肿瘤效果。 在论文第三章，我们设计出了能逐步响应环境刺激，同时协同了化疗和光动力治疗的剌激响应型纳米胶束。DLS结果显示胶束在酸性环境和还原性环境下，胶束粒径有所变化。髙效液相色谱(HPLC)结果进一步证实，胶束在酸性环境，首先断裂出前药小分子PBA-SS-CPT，之后在GSH刺激下，进一步转化成CPT。细胞吞噬实验中，细胞流式结果显示原卟啉能通过光化学内在化作用增强胶束的内吞。载药胶束的细胞毒性实验显示，由于光敏剂PpIX的存在，光照会增加Dex-g-PpIX-g-PBA-SS-CPT(DPPSC)胶束的细胞毒性，同时，由于胶束逐步地响应细胞内外的环境，导致了药物的髙效释放，从而导致了细胞毒性的增加。短时的光照能促进整个胶束逃逸溶酶体，同时，由于溶酶体内的酸性环境，PBA-SS-CPT能很好的从胶束中脱落，然后进入细胞质。利用了多种共定位分析方法对细胞的CLSM图进行定量和定性分析，结果表明DPPSC胶束在细胞中逐步响应释放药物。进一步通过HPLC检测，定性和定量的验证了PBA-SS-CPT在细胞质中能更好的转化成CPT。用胶束和裸药进行荷PANC-1肿瘤裸鼠治疗后，DPPSC胶束组在2种不同策略光照下，小鼠肿瘤生长最慢，小鼠体重变化不大，并且整组小鼠存活时间最长。治疗末期取出小鼠肿瘤做组织学切片。通过H&E染色和TUNEL染色证明了材料的安全性以及DPPSC胶束组在2种策略光照下，肿瘤细胞凋亡最明显，从组织学层面说明了DPPSC胶束的药效。 在论文最后一章，成功合成出以四氧化三铁作磁靶向，三苯基膦阳离子(TPP)作为线粒体靶向，DOX作为化疗药物结合聚多巴胺(PDA)热疗的纳米颗粒。近红外成像结果显示，包裹多巴胺的颗粒，在光照6分钟后，温度快速的升高了18度以上。DOX的释药实验表明，酸性条件下DOX的释放快于中性条件，同时，NIR光照下，DOX的释放明显加快。细胞相容性实验结果表明，空白材料对细胞无毒性，但在NIR光照射条件下，材料的细胞毒性增加，由于二硫键的断裂，TPP靶向线粒体，促使对热敏感的肿瘤细胞线粒体的破坏，加速了肿瘤细胞的凋亡，因此Fe3O4@PDA-TPP/-SS-mPEG和Fe3O4@PDA-TPP/-mPEG的细胞毒性出现显著差异。与此同时，通过活死细胞荧光染色也能观察到，只有光照区域的细胞才会死亡。细胞CLSM图显示只有二硫键连接的mPEG才能从纳米颗粒上掉落下来，从而暴露出TPP靶向单元，进而靶向线粒体，荧光的共定位分析结果也进一步说明了这一点。动物实验结果显示，在光照情况下，双靶向光热疗结合化疗组小鼠肿瘤增长最缓慢，小鼠体重无明显变化，并且小鼠存活率最高，说明该颗粒更好地抑制肿瘤增长同时具有髙的安全性。

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