氧化钛纳米管微沟槽表面细胞外基质的构建及其性能研究

摘要

目前用于治疗心血管疾病植入的医疗器械及材料均会对血管内膜造成不同程度的损伤，进而诱发血管的再狭窄，而在其表面实现良好的内皮化被认为是解决该问题的重要途径。近些年，随着对干细胞功能及作用等研究的深入，发现间充质干细胞可以被调控分化为血管细胞，本研究组前期结果也表明其在材料诱导下有向平滑肌或类平滑肌方向分化的趋势，如何使其向内皮方向发生分化并进一步提升材料表面的各项性能成为后续研究重点。同时，内皮细胞全细胞外基质因其良好的生物相容性及诱导间充质干细胞向内皮方向分化的可能性而被我们关注。基于此，本文在所得微纳米结构上进行全细胞外基质的修饰，研究该复合表面的性能及其对二次接种细胞行为的影响，为血管内皮化的仿生构建提供了一条可能的路径。
　　本文首先借助光刻技术和阳极氧化技术等成功制备出五组基底样品:平板钛样品(TiO2)、纯纳米管样品(nano)、二维微纳复合样品(gro-nano)、微米沟槽样品(topo)及三维微纳复合样品(topo-nano)作为对照组。借助脱细胞技术，在各组材料样品表面构建内皮细胞的全细胞外基质，获得ECM/TiO2、 ECM/nano、ECM/gro-nano、ECM/topo、ECM/topo-nano样品作为实验组。随后借助光镜、荧光显微镜、傅里叶转换红外光谱、水接触角、扫描电子显微镜等检测方法及手段对各组样品进行表征，并对其的血液相容性、抗炎能力及内皮细胞相容性进行评价，最后研究其对间充质干细胞分化行为的影响。
　　材料学表征显示，所得样品表面图形（沟脊）宽纹理（沟）为20μm，窄条纹（脊）为10μm，纳米管管径为70nm左右。修饰后样品表面均有细胞外基质的的存在，借助Ⅳ型胶原染色，初步观察到其粘附程度及分布情况。
　　实验证明，细胞外基质的修饰，极大程度的提高了材料表面的血液相容性及抗炎能力。二次接种内皮细胞的结果则表明，细胞外基质的存在对内皮细胞的粘附、增殖等行为有促进作用。虽然细胞外基质的存在削弱了二维图形(gro-nano)对细胞取向性生长的诱导作用，但对三维立体结构(topo，topo-nano)影响不大。
　　间充质干细胞的培养实验表明，短期培养（5天）时细胞仍呈现CD44阳性，α-sma及vWF阴性;长期培养（2周）时无细胞外基质修饰的nano、gro-nano、topo及topo-nano样品表面间充质干细胞有向平滑肌方向分化趋势，而细胞外基质修饰样品ECM/TiO2、 ECM/nano、ECM/gro-nano、ECM/topo、ECM/topo-nano表面间充质干细胞则有向内皮方向分化趋势。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 生物材料及其表面改性

1．1．1 生物材料及生物相容性

1．1．2 生物材料表面改性的研究及发展趋势

1．2 图形化技术用于表面改性的研究

1．2．1 微米图案的研究

1．2．2 纳米图案的研究

1．2．3 微纳复合图案的研究

1．3 基于细胞外基质的表面改性

1．3．1 脱细胞技术

1．3．2 脱细胞所得细胞外基质的功能

1．4 间充质干细胞向血管相关细胞的定向分化

1．4．1 间充质干细胞向血管相关细胞分化的理论基础

1．4．2 间充质干细胞向血管相关细胞分化研究

1．5 本课题的研究意义，目标内容以及技术路线

1．5．1 本课题的研究意义

1．5．2 本课题研究目标和内容

1．5．3 技术路线

第2章 基底结构制备及其表面细胞外基质的构建

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂及仪器

2．2．1 实验材料及试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 基底结构的制备

2．3．1 平板钛样品(TiO2)制备

2．3．2 纯纳米管样品(nano)的制备

2．3．3 二维微纳复合样品(gro-nano)的制备

2．3．4 微米沟槽样品(topo)制备

2．3．5 三维微纳复合样品(topo-nano)的制备

2．4 细胞外基质的构建

2．4．1 内皮细胞的获取

2．4．2 细胞的接种及培养

2．4．3 脱细胞的实现

2．5 表征方法及原理

2．5．1 免疫荧光染色

2．5．2 水接触角

2．5．3 傅氏转换红外光谱分析仪

2．5．4 扫描电子显微镜

2．6 实验结果与讨论

2．6．1 一次内皮细胞培养及脱细胞结果

2．6．2 细胞外修饰前后水接触角结果

2．6．3 细胞外基质修饰前后傅里叶红外光谱结果

2．6．4 细胞外基质修饰前后Ⅳ型胶原染色结果

2．6．5 细胞外基质修饰前后扫描电镜结果

2．7 本章小结

第3章 细胞外基质修饰的微纳复合结构表面生物学评价

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂及仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器与耗材

3．3 实验方法及内容

3．3．1 血小板实验

3．3．2 巨噬细胞实验

3．3．3 内皮细胞实验

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 细胞外基质修饰前后血小板粘附及激活结果

3．4．2 细胞外基质修饰前后巨噬细胞实验结果

3．4．3 细胞外基质修饰前后内皮细胞实验结果

3．5 本章小结

第4章 胞外基质修饰的微纳复合结构对干细胞的影响

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂及仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器与耗材

4．3 间充质干细胞的获取、培养及接种

4．3．1 间充质干细胞获取及鉴定

4．3．2 间充质干细胞接种

4．3．3 间充质干细胞频繁换液培养

4．4 各体系对干细胞调控与诱导的探索

4．4．1 短期及长期CD44因子的检测

4．4．2 短期及长期α-sma因子的检测

4．4．3 短期及长期vWF因子的检测

4．5 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文及参与科研项目