人废弃胚胎单卵裂球体外发育研究

摘要

对胚胎卵裂球拆分，形成单卵裂球并培养获得妊娠在动物实验中已有报道。由于早期胚胎具备全能性，因此从胚胎中分离单个卵裂球使其细胞数增多甚至发育成囊胚成为可能。胚胎分割成为卵裂球后培养获得的囊胚和分割前的胚胎相比，具备了相同的基因组信息，体外培养获得的新的胚胎，移植后获得的个体基因型必然完全相同，如果发育顺利，就可以凭借这种方法得到与分割前胚胎基因型完全一致的个体，也就实现了以有限的资源而获得大量的扩增。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在雌性动物的生殖道内合成，并且与啮齿动物、家畜等移植前胚胎的生长发育密切相关，动物实验提示粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以作为胚胎继续发育的“存活因子”。小鼠移植前的胚胎可表达GM-CSF受体的α-链，向培养液中加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠卵裂期胚胎生长发育、囊胚的形成以及后续的贴壁粘附有利。因此卵裂球的体外培养成为实现上述资源扩增的基础，本研究首先以捐赠的胚胎为基本材料，探讨了培养液配置时间、卵裂球培养时间、液滴的体积对卵裂球发育能力的影响，从而得到了此时卵裂球的最佳培养条件，然后在此条件下，以冷冻胚胎为材料，获得了最适的重组粒-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocytemacrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF)浓度，最后以此最适细胞因子浓度的培养液为基础，对来源于捐赠的新鲜第三天劣质胚胎的单卵裂球培养，并获得良好效果。最佳卵裂球体外培养条件的得出，为后续干细胞培养以及干细胞建系等提供了前期的实验基础。
　　为得出最佳的卵裂球体外培养条件，将解冻的120个优质胚胎采用激光破除透明带后，获得863个卵裂球，单独培养至第六天。（探讨微滴体积10ul、20ul、30ul、40ul对卵裂球后期发育的影响（40个胚胎，339个卵裂球）。（探讨培养液平衡时间分别为2h、4h、20h、24h对卵裂球后期发育的影响(40个胚胎，334个卵裂球)。（探讨卵裂球的培养时间分别为D3、D4、D5、D6对卵裂球后期发育的影响(40个胚胎，340个卵裂球)。比较各组的单卵裂球分裂率、致密化率和囊胚形成率。探讨卵裂球的培养时间对卵裂球发育的影响时，还需另讨论培养至最后一天剩余的囊胚数。结果依卵裂球体外培养形成囊胚的数目的多少来看，当微滴体积20ul、培养时间是D3、液体平衡20h时囊胚形成率最高，因此得到最佳培养条件为微滴体积20ul、培养时间是D3、液体在解冻前20小时配置。
　　为探索单卵裂球培养所需的rhGM-CSF浓度，以0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml分组，共解冻了46枚胚胎，应用所得的最佳培养条件对单卵裂球行囊胚培养，结果显示，0.4ng/ml组虽然卵裂球的分裂率不是最高，但是致密化率和囊胚形成率均得到最大，囊胚计数结果显示，0.4ng/ml组平均每个囊胚的细胞数目最多为30.36±12.75,显著高于0.2ng/ml组和0.6ng/ml组。与空白对照组相比，0.4ng/ml的rhGM-CSF显著提高了单卵裂球的分裂率以及囊胚形成率。
　　为了研究细胞因子对劣质胚胎（均为Ⅳ级胚胎）的作用效果，本研究挑选了取卵后的第三天的胚胎，实验组添加细胞因子20枚胚胎，对照组不添加任何物质的空白培养液10枚胚胎，结果显示，实验组的卵裂球分裂率、致密化以及囊胚形成率均显著上升。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 课题来源

1．2 研究背景及文献综述

1．2．1 人类胚胎体外培养发展史

1．2．2 单卵裂球与发育

1．2．3 胚胎最适培养条件

1．2．4 细胞因子与卵裂球的体外培养

1．2．5 胚胎质量与发育

1．2．6 本研究中使用到的方法

1．2．7 卵裂球体外培养意义

1．2．8 卵裂球体外培养存在的问题

1．3 本研究的主要流程以及意义

第2章 单卵裂球培养条件的初步探索

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 所需溶液的配置

2．2．2 胚胎分级标准

2．2．3 胚胎解冻

2．2．4 单卵裂球的获得

2．2．5 评价指标

2．2．6 结果的计算

2．3 试验设计

2．3．1 微滴体积对单个卵裂球发育的影响

2．3．2 培养时间对单卵裂球发育的影响

2．3．3 液体的平衡时间对卵裂球发育的影响

2．4 数据处理

2．5 实验结果及结论

2．5．1 解冻的胚胎构成

2．5．2 结果

2．6 讨论

2．7 小结

第3章 外源细胞因子rhGM-CSF对卵裂球的作用

3．1 实验材料、仪器及试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．2 试验方法

3．2．1 所需溶液的配制

3．2．2 囊胚的Hoechst33342法染色

3．2．3 试验设计

3．3 数据分析

3．4 结果

3．5 讨论

3．6 小结

第4章 细胞因子应用于劣质新鲜胚胎单个卯裂球体外培养

4．1 试验材料、仪器及试剂

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验仪器及试剂

4．2 试验方法

4．2．1 胚胎的来源

4．2．2 液体配置

4．2．3 实验设计

4．3 数据分析

4．4 实验结果

4．5 讨论

4．6 小结

结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士期间的主要成果