栉孔扇贝和长牡蛎精子膜蛋白的提取及初步鉴定

摘要

精子是雄性生物生殖过程中产生的一种高度分化的特殊细胞。精子膜是液态镶嵌的脂质双分子层结构，由多种糖蛋白、脂蛋白或糖、脂复合物构成，人们经常称之为精子膜蛋白。现己研究证明，精子膜蛋白在精子获能、顶体反应、精卵识别等过程中均起着非常重要的作用，是精子功能得以实现的主要物质，对精子完成各种生理生化反应及生殖功能起着至关重要的作用。 栉孔扇贝(Chlamys farreri)和长牡蛎(Crassostrea gigas)是我国北方海水养殖的主要贝类种类，肉鲜味美，具有很高的营养价值和经济价值。精子膜蛋白的研究，对于了解双壳贝类在精子获能、顶体反应、精卵识别等机制及扇贝育种具有重要意义。本文从提取、分离、生化性质分析与比较等方面对精子膜蛋白进行了初步鉴定和研究，为其受精生物学、遗传学及发育生物学方面的深入研究提供参考资料。具体结果如下： 1.栉孔扇贝精子膜蛋白的提耿、分离和初步分析。通过SDS-PAGE电泳，从提取液的倍数、提取时间、TritonX-100的浓度、SDS的有无等四个方面对提取条件进行优化，确定栉孔扇贝精子膜蛋白的最佳提取条件：将精液150g离心去除底层精原细胞，0.1 mol/L PBS缓冲液和0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液分别清洗两次，3000g离心得精子悬液，加入3倍体积含1％ TritonX-100和0.1％SDS的膜蛋白提取液中冰浴振摇1.5h；50000g离心15min，收集上清精子膜蛋白溶液。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件下，对其精子膜蛋白组分和分子量、糖蛋白、脂蛋白等生化性质的进行分析，测定其精子膜蛋白溶液的蛋白含量，结果显示，栉孔扇贝精子膜蛋白浓度为0.67mg/mL，考马斯亮蓝R.250染色检测出精子膜蛋白有22种，分子量在23～156kDa之间，PAS染色检测出糖蛋白有13种，苏丹黑B染色检测出脂蛋白有12种，分析得有8种精子膜蛋白既为糖蛋白又为脂蛋白。此研究结果可为进一步分离纯化栉孔扇贝的精子膜蛋白，研究其在精子发生和受精过程中的功能提供基础资料。 2．长牡蛎精子膜蛋白的提取、分离和初步分析。利用SDS-PAGE电泳从提取时间、TritonX-100的浓度二个方面对提取条件进行优化，确定长牡蛎精子膜蛋白的最佳提取条件：将精液150g离心去除精原细胞，0.1 mol/L PBS缓冲液和0.1 mol/LTris-HCl缓冲液分别清洗两次，3000g离心得精子悬液，加入三倍体积含1％TritonX-100的膜蛋白提取液，冰浴振摇1h；50000g离心15min，收集上清精子膜蛋白溶液。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件下，对其精子膜蛋白组分的部分生化性质进行分析。结果表明，考马斯亮蓝R-250染色检测出21种精子膜蛋白，分子量在26～156kDa之间；PAS染色检测出糖蛋白有14种，苏丹黑B染色检测出脂蛋白有17种，分析得有13种精子膜蛋白既为糖蛋白，又为脂蛋白。此结果可为进一步研究其在精子发生和受精过程中的作用及功能提供基础资料。 3．栉孔扇贝精子膜蛋白与长牡蛎精子膜蛋白部分生化性质的比较。通过研究两者精子膜蛋白的部分生化性质，分析得其在种类、分子量、糖蛋白、脂蛋白等方面结果一致，初步推断这两种双壳贝类的精子膜蛋白在这几个生化性质方面具有一定的保守性。此实验需进一步研究证明。 4．栉孔扇贝卵黄膜蛋白的提取。通过镜检和涂片实验确定用PBS缓冲液和 Tris-HCl缓冲液清洗卵子后，卵子保持较好的形态，加入膜蛋白提取液后，卵子部分破碎，SDS—PAGE电泳检测卵黄膜蛋白与卵内物质蛋白未分离开，说明采用去污剂提取卵黄膜蛋白是不可行的，这一结论需要进一步的研究。 本文在栉孔扇贝和长牡蛎精子膜蛋白的提取分离及其生化性质的测定分析等方面进行了初步的研究和探索，对这两种双壳贝类精子膜蛋白的部分生化性质进行了比较分析，关于这两种精子膜蛋白在受精过程中的具体作用及其保守性，仍有待于进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章精子膜蛋白及卵膜蛋白的研究现状

1精子膜蛋白的研究现状

1.1栉孔扇贝与长牡蛎精子的形态结构

1.2精子膜蛋白

2卵膜蛋白的研究现状

2.1栉孔扇贝卵子的形态结构

2.2卵膜蛋白

3研究的目的和意义

第二章栉孔扇贝精子膜蛋白的提取分离及初步鉴定

第一节栉孔扇贝精子膜蛋白的提取及分离

0引言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

第二节栉孔扇贝精子膜蛋白部分生化性质的研究

0引言

1材料与方法

2实验结果及分析

3讨论

第三章 长牡蛎精子膜蛋白的提取及其部分生化性质与栉孔扇贝精子膜蛋白的比较与研究

第一节长牡蛎精子膜蛋白的提取及初步鉴定

0引言

1材料与方法

2结果

3 讨论

第二节长牡蛎精子膜蛋白部分生化性质的研究及与栉孔扇贝精子膜蛋白的比较

0引言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

第四章栉孔扇贝卵膜蛋白的提取与分离

0引言

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

小结

参考文献

附录

致谢