雪胆素甲抑制非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549的增殖效应及其作用机制

摘要

背景：肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤的第一位。病理组织可将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中80%为非小细胞肺癌。目前，治疗肺癌的手段主要包括手术、放疗、化疗及靶向治疗。肺癌患者的5年生存率低于15%。由于早期肺癌症状不明显，患者就医确诊时多为中晚期，往往已错失了手术的机会。临床治疗多以化疗为主。由于现有的临床化疗药物毒副作用大，疗效有限，研究新型抗肿瘤药物以提高患者生存率迫在眉睫。近年来，随着药物提取及分离技术的不断发展，天然产物用于抗肿瘤的研究有了显著的提高。我国的天然产物丰富，为研究提供了多种原材料。雪胆素甲（CucurbitacinⅡa,CuⅡa）是葫芦科雪胆属所提取的一种四环三萜类天然化合物。雪胆素甲药理活性主要集中抗菌和抗炎两方面。近年来，雪胆素甲对非小细胞肺癌A549细胞增殖具有抑制作用被报道，但未对其分子机制进行阐明。本论文在两种非小细胞肺癌NCI-H460和A549中证实了雪胆素甲对肿瘤细胞增殖抑制作用，并进一步探究其分子机制，为雪胆素甲作为抗肿瘤药物的应用提供理论基础及实验依据。 目的：以非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549为细胞研究模型，探究雪胆素甲抑制非小细胞肺癌的增殖效应及作用机制。 方法： 1. 雪胆素甲以0、1.6、8、40、2000、10000和50000nM浓度作用非小细胞肺癌NCI-H460和A549细胞48h，CCK-8法检测细胞活性。 2. 雪胆素甲以200nM浓度作用细胞24h，检测细胞克隆形成率。 3. 雪胆素甲以0、0.4、0.8、1.6μM浓度作用细胞12h，Annexin V-PE/7-AAD双染色流式检测早期凋亡细胞的比例以及Western-Blot检测相关凋亡蛋白caspase3和cleaved-PARP。 4. 雪胆素甲以0、0.4、0.8、1.6μM浓度作用细胞48h后，PI染色流式检测细胞周期比例。 5. 雪胆素甲以0、0.4、0.8、1.6和3.2μM浓度作用细胞12h，WB检测AuroraA、STAT3和cofilin表达及其磷酸化水平含量。其中S2270作为P-AuroraA阳性对照，Ruxolitinib作为P-STAT3阳性对照。 结果： 1. CCK-8实验结果显示雪胆素甲可抑制非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549的增殖，呈现剂量依赖性。雪胆素甲对NCI-H460和A549的IC50分别为108.3和224.9nM。 2. 雪胆素甲200nM浓度作用细胞系NCI-H460和A549的克隆形成率分别为6.7%± 2.4%和10.1%± 2.5%。 3. Annexin V-PE/7-AAD双染色流式检测结果显示，NCI-H460早期凋亡细胞比例由4.3%增加到30.3%，A549由2.4%增加到24.6%。WB检测结果显示雪胆素甲可caspase3表达水平及凋亡活化标志片段cleaved-PARP的含量显著增加。 4. PI流式检测结果显示，NCI-H460处于G2/M期细胞比例由22.2%增加到45.3%，A549处于G2/M期细胞比例由26.5%增加到51.2%。 5. Western-blot结果显示AuroraA、STAT3和cofilin蛋白磷酸化水平含量减少。 结论： 1. 雪胆素甲可抑制非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549增殖。 2. 雪胆素甲可诱导细胞凋亡，其机制之一与caspase3的表达上调且激活caspase3信号通路及抑制STAT3的磷酸化而阻断Jak/STAT信号通路；同时与cofilin磷酸化显著减少而细胞骨架微丝结构的破坏有关。 3. 雪胆素甲通过抑制蛋白激酶AuroraA磷酸化阻滞肺癌细胞细胞周期于G2/M期。

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第1章 绪 论

1.1肺癌的现状

1.2葫芦素类化合物的研究现状

1.2.1化学结构

1.2.2抗癌活性

1.2.3抗炎活性

1.2.4降糖活性

1.2.5其他生物活性

1.2.6药物联用

1.3本课题的研究目的与意义

第2章 雪胆素甲对细胞增殖的影响

2.1引 言

2.2.1主要实验仪器

2.2.2主要实验试剂

2.2.3主要试剂配制

2.3.1细胞复苏

2.3.2细胞培养及传代

2.3.3细胞冻存

2.3.4雪胆素甲对NCI-H460和A549细胞活性检测

2.3.5细胞克隆形成实验

2.4统计方法

2.5实验结果

2.5.1雪胆素甲抑制细胞活性

2.6本章小结

第3章 雪胆素甲诱导细胞凋亡及其机制

3.1引 言

3.2.1主要实验仪器

3.2.2实验试剂

3.2.3试剂配制

3.3方法

3.3.1细胞凋亡检测

3.3.2蛋白免疫印记

3.4统计学方法

3.5.1雪胆素甲诱导细胞凋亡

3.5.2雪胆素甲上调caspase3和cleaved-PARP表达水平

3.5.3雪胆素甲抑制STAT-3磷酸化

3.5.4雪胆素甲抑制cofilin磷酸化

3.6本章小结

第4章 雪胆素甲阻滞细胞周期及其机制

4.1引 言

4.2.1主要实验仪器

4.2.2实验试剂

4.3实验方法

4.3.1细胞周期检测

4.3.2 AuroraA蛋白检测

4.4.1雪胆素甲阻滞细胞周期于G2/M期

4.4.2雪胆素甲抑制AuroraA磷酸化

4.5本章小结

结 论